硫胺素缺乏小鼠脑内Tau 蛋白病理特征分析

万文斌，桑绍明，钟春玖

1. 上海交通大学医学院附属仁济医院神经内科，上海 200127；2. 复旦大学附属中山医院神经内科，上海 200032

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是最常见的中枢神经系统（central nervous system， CNS）退行性疾病，也是痴呆的最常见类型，其主要临床表现有以记忆减退为主要表现的进行性认知功能障碍及其他神经精神症状［1］，病理上以脑内 β-淀粉样蛋白（β-amyloid， Aβ）沉积形成老年斑（senile plaque， SP）、过度磷酸化Tau （hyperphosphorylated Tau）蛋白聚集形成神经纤维缠结（neurofibrillary tangles， NFT）及神经突触损伤、神经元丢失为特征性改变［1］。

越来越多的基础及临床研究显示，硫胺素代谢障碍与AD 发病关系密切［2-3］，但硫胺素代谢障碍对Tau病理形成的影响尚不清楚。 因此，本实验通过构建硫胺素缺乏（thiamine deficiency， TD）小鼠模型，分析其脑内Tau 蛋白病理改变特征。 从而为硫胺素代谢障碍致AD 相关病理产物的形成提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物3月龄 SPF 级 C57／BL6 小鼠由中国科学院上海斯莱克实验动物中心提供，标准环境下饲养，自然照明，自由进食和饮水。 本实验由复旦大学附属中山医院伦理委员会审批同意，所有动物实验相关操作符合动物实验伦理要求。

1.2 主要设备与试剂硫胺素缺乏小鼠颗粒饲料及对照饲料（中国Trophic 公司订制）、吡啶硫胺素（美国Sigma）、 Tau5 抗体（英国 Abcam）、 AT8 抗体（美国Pierce）、磷酸化 Tau S396 （p-Tau S396）抗体（德国CST）、磷酸化 Tau T181 （p-Tau T181）抗体（德国CST）、 IRDye® 680LT／800CW 二抗（美国 Li-Cor）、蛋白酶抑制剂（瑞士 Roche）、 BSA（美国 Amresco）、横冷冰冻切片机（德国徕卡CM1950）。 垂直电泳转印系统（美国Bio-Rad）、 Odyssey 双色红外激光成像系统（美国 Li-Cor）、 HPLC（美国 Agilent）、超纯水净化仪（美国 Millipore）、电子天平（美国 Mettler Toledo）。

1.3 动物分组及硫胺素缺乏小鼠模型构建将小鼠随机分为2 组（正常对照组和硫胺素缺乏组），硫胺素缺乏组予硫胺素缺乏颗粒饲料联合吡啶硫胺素（剂量500 μg／kg·d）腹腔注射，正常对照组予正常饮食联合等体积生理盐水腹腔注射。

1.4 标本采集与制备小鼠处理10 d 后取脑，分离海马组织和称定质量记录，在预冷的生理盐水中漂洗1 次放入液氮中，再放入-80 ℃冰箱中保存。 用于高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测硫胺素含量的标本经KH2PO4处理后用研磨机震荡预处理后冻存，用于Western Blot 检测的标本加入含蛋白酶抑制剂的裂解液经研磨震荡、裂解提取组织蛋白，测定浓度后冻存。 用于免疫荧光染色的小鼠经冰生理水心脏灌流后予以4% PFA 固定后按程序性脱水处理，横冷切片机切片后置于冻存液中保存。

1.5 HPLC 检测参照高效液相色谱法《中国药典》2015年版四部通则0631，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-磷酸氢二钾水溶液（25 mmol／L， pH值7.0）为流动相，梯度洗脱（参数如表1 所示），荧光检测：激发波长为375 nm，吸收波长为435 nm。

表1 HPLC 检测参数

1.6 Western Blot 蛋白检测蛋白样品加入上样缓冲液后进行上样电泳，积层胶电压60 V，分离胶电压100 V，转膜采用电压70 V 持续120 min，5%BSA 封闭后一抗孵育在4 ℃过夜，复温后IRDye®680LT／800CW二抗孵育用Odyssey 近红外成像系统扫膜。

1.7 统计学分析数据采用经SPSS 19.0 统计软件处理进行分析。 计量资料经正态性检验与方差齐性检验后，正态分布且方差齐性的计量资料据均用均数 ± 标准差（）表示， 2 组间比较行独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 硫胺素缺乏小鼠脑内硫胺素代谢产物含量降低体内硫胺素主要包括游离硫胺素（free thiamine，fT）、一磷酸硫胺素（thiamine monophosphate， TMP）及二磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate， TDP）3 种衍生物，其中TDP 是硫胺素的主要储存和转运形式，也是执行硫胺素参与线粒体能量代谢的主要成分。 为此，采用HPLC 对硫胺素缺乏小鼠脑组织中硫胺素的3 种成分进行测定。

与对照组比较，硫胺素缺乏小鼠全血TDP、 TMP及fT 水平均降低，定量分析显示与对照小鼠比较分别减少82%、 80%及63%（P＜0.01）。 对脑组织的分析也观察到一致的结果。 硫胺素缺乏小鼠大脑皮层TDP、 TMP 及fT 水平与对照小鼠比较分别降低86%、97%及94% （P＜0.01）；硫胺素缺乏小鼠海马组织TDP、 TMP 及fT 水平与对照小鼠比较分别降低79%、95%及 96%（P＜0.01）。 见图 1。

图1 硫胺素缺乏小鼠脑内硫胺素代谢产物水平测定

2.2 硫胺素缺乏促进Tau 蛋白磷酸化Tau 蛋白是神经元中含量丰富的微管相关蛋白，其功能在于促进微管组装及维持微管的结构稳定。 在AD 中， Tau 蛋白过度磷酸化是重要的特征性病理改变，其在认知功能障碍的发生发展中起重要作用［4］。 既往前期已发表研究提示，硫胺素与Tau 蛋白病理形成关系密切［2］。

蛋白印迹检测显示硫胺素缺乏小鼠皮层及海马中S202 和 T205 双位点磷酸化 Tau（p-Tau S202，T205， AT8） 水平分别增加了 2 倍与 1. 2 倍 （P＜0.01）。 对经典 Tau 蛋白磷酸化位点 T181、S396 进行了检测显示，在硫胺素缺乏小鼠皮层， pT181 及pS396蛋白水平分别增加了 1.3 倍及 2 倍（P＜ 0.01），在硫胺素缺乏小鼠海马， pT181 及pS396 蛋白水平分别增加了 1 倍及 0.3 倍（P＜0.01）。 见图 2。

图2 硫胺素缺乏小鼠脑内过度磷酸Tau 蛋白水平增加

2.3 硫胺素缺乏引起Tau 蛋白异常聚集从蛋白印迹条带分布可以看出，硫胺素缺乏小鼠存在Tau 蛋白出现条带迁移（mobility shift），即膜上免疫印迹结果显示硫胺素缺乏小鼠脑组织Tau 蛋白条带向分子量大的位置迁移。 与对照组比较，硫胺素缺乏组Tau 蛋白分子量显著增加。 蛋白条带迁移意味着蛋白空间构象改变及翻译后与其他蛋白耦合等可能。 然而由于含0.1% SDS、1% Triton X-100 的强效裂解液对总蛋白进行提取，在SDS 和Triton X-100 的作用下可破坏蛋白间相互作用，从而将翻译后的蛋白耦合成分去除，推测可能存在Tau 蛋白异常聚集导致的蛋白条带迁移。既往已有文献报道AD 患者及动物模型中存在Tau 蛋白过度磷酸化聚集形成的空间构象改变，蛋白强变性剂尿素（Urea）可使聚集的 Tau 蛋白充分解螺旋［5］。 利用尿素处理后再次对Tau 蛋白进行电泳鉴定。 经尿素处理后，硫胺素缺乏小鼠皮层及海马组织Tau 蛋白磷酸化变化趋势同前，然而通过蛋白条带位置反映的Tau 蛋白分子量显示硫胺素缺乏小鼠与正常对照小鼠基本一致，蛋白条带迁移现象被尿素处理逆转。 本结果也提示Tau 蛋白过度磷酸化可能是导致其在免疫印迹检测时出现条带迁移的原因，硫胺素缺乏使通过引起Tau 蛋白异常磷酸化，从而导致蛋白的异常聚集。 见图3。

图3 硫胺素缺乏小鼠脑内Tau 空间构象改变

2.4 硫胺素缺乏增加难溶性Tau 蛋白组分除过度磷酸化及蛋白异常聚集导致空间构象改变以外，难溶组分含量增加是AD 中Tau 蛋白变化的另一个重要病理表现形式［6-7］。 采用Sarkosyl 分离可溶性和难溶性Tau蛋白，结果显示硫胺素缺乏小鼠脑组织中可溶组分Tau蛋白水平与正常对照组无显著差异（P＞0.05），但难溶组分 Tau 蛋白水平显著增加（P＜0.01）。 见图 4。

图4 硫胺素缺乏小鼠脑内难溶性Tau 蛋白水平增加

3 讨论

以Aβ 为核心的发病机制假说（Aβ 级联假说）是目前AD 领域最广为接受的病因假说。 Aβ 假说认为各种原因引起的Aβ 生成异常增加以及清除障碍，脑内Aβ 过度沉积形成神经毒性SP，继而诱发包括Tau蛋白病理、线粒体功能障碍、氧化应激、神经元损伤等一系列级联效应，最终导致认知功能减退及AD 病程进展［8］。 因此清除脑内 Aβ 沉积是研究 AD 治疗领域的重要课题。 然而研究表明，脑内Aβ 沉积并不与AD病情成正相关，三分之一认知功能正常的77岁以上老年群体脑内Aβ 沉积达到AD 诊断标准、约50%认知功能正常的82岁以上老年群体脑内Aβ 沉积达到AD诊断标准［9-11］。 可见， Aβ 沉积过程可能独立于 AD 认知功能损害的进展。 更重要的是，近十年来基于该假说的多项Aβ 相关临床药物试验均宣告失败［12-14］。 这提示可能存在脑糖代谢障碍是AD 病程中恒有的病理生理改变。 大量临床与基础研究证实AD 患者早期即存在大脑葡萄糖代谢异常，脑糖代谢障碍明显早于临床症状的出现，甚至有研究发现早于AD 发病数十年［15-17］，提示大脑葡萄糖代谢障碍在AD 发病中的关键作用。然而，对于脑糖代谢障碍的诱发因素学界仍未找到确切答案。

越来越多的基础研究及临床循证依据显示硫胺素代谢障碍可能是AD 超早期的潜在病理改变［2-3］。AD 患者脑细胞中，以硫胺素作为辅酶的α-酮戊二酸脱氢酶（α-ketoglutarate dehydrogenase， KGDH）、丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase， PDH）和转酮醇酶（Transketolase， TK） 活性下降显著［18-19］，且 PDH 和KGDH 与 AD 临床病情评定等级高度相关［20］。

Tau 蛋白空间构建改变出现聚集继而引起难溶性组分增加是 AD 中 Tau 蛋白病理的经典类型［21］。 本研究利用硫胺素缺乏小鼠模型对Tau 蛋白病理进行的检测分析，发现硫胺素缺乏不仅能显著诱导Tau 蛋白过度磷酸化含量增加，还能可引起Tau 蛋白空间构建变化及难溶性Tau 蛋白组分增加。 因此，该结果也为硫胺素代谢障碍致AD 病变提供了实验依据。

本研究首次阐述了硫胺素代谢障碍引起Tau 蛋白异常聚集及难溶性Tau 蛋白组分增加等AD 相关特征性病变，为硫胺素代谢障碍参与AD 发病的相关机制提供了实验依据。 然而，本实验未明确硫胺素代谢障碍致Tau 蛋白异常聚集的电镜结构特征及难溶性Tau蛋白组分形成的内在机制，这也是本实验下一步的研究探索方向。