基于UV-Vis光谱法的靛蓝提取物光氧化降解研究

刘丹阳， 颜洋洋， 王成章

(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；江苏省生物质能源与材料重点实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心；江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210042)

靛蓝是一种来自植物的古老的天然染料，被广泛应用于纺织、木器和绘画等领域[1]。当前大部分牛仔衣物的染料是合成靛蓝，年产量数万吨。由于靛蓝在牛仔衣物染色中的大量使用，产生了很多污水，因此，很多学者致力于使用化学催化剂[2-3]或生物法[4]加以处理，以期更快降解靛蓝[5]或靛蓝胭脂红[6]。而有研究发现[7-9]天然靛蓝提取物溶液放置几小时后会有颜色褪去现象，也有报道珍贵的古代书画或丝织品中颜料靛蓝的颜色会随时间褪色，从而造成资源浪费和艺术品损失。因此，在靛蓝提取物的含量测定、珍贵文物或纺织品的保存过程中，需要尽量避免靛蓝的降解[10-11]，但是关于靛蓝光照稳定性的相关研究较少。Novotna等[12]研究发现靛蓝降解产物中有靛红、异酸酐、邻氨基苯甲酸、色胺酮以及其他未知化合物，且天然靛蓝降解率高于合成靛蓝；Sousa等[13]研究发现过氧化物或其他氧基自由基在靛蓝的降解中起关键作用，溶液和凝胶介质中的靛蓝降解产物主要是靛红；Gandra等[14]研究发现靛蓝和靛蓝胭脂红在辐照后形成单线态分子氧，量子产率分别为0.6和0.3～0.5；张笑河等[15]研究得到食用靛蓝降解率与光照时间之间的指数关系，可方便地检测食用靛蓝的降解率。本研究测定了溶液质量浓度、光照时间和光照方式对合成靛蓝标准品吸收光谱的影响，建立了溶液中靛蓝降解影响因素模型，得到了靛蓝光降解率与不同影响因素之间的关系，并进一步分析了光照时间及光照方式对靛蓝提取物降解过程及产物的影响，以期在实际应用中尽量避免靛蓝的降解，从而指导染色工艺、色彩保存或实际检测工作。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

马蓝叶发酵制备的靛蓝膏购自贵州省独山县麻尾工业园区，靛蓝质量分数为2%～5%，含水量50%～60%。靛蓝标准品(纯度97%)、靛红标准品(纯度98%)，阿拉丁试剂公司；二甲基亚砜(DMSO)等试剂均为分析纯。

KH5200DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；UV-1800PC型紫外可见分光光度计，上海美谱达有限公司；CBM-10A VP Plus高效液相色谱(HPLC)仪，日本岛津公司。

1.2 靛蓝标准品溶液的光氧化降解实验

1.2.1光照时间的影响 在室内自然光条件下，将不同质量浓度的靛蓝标准品溶液放置0、 1、 2、 5、 17、 18、 19、 20、 21和24 d，然后用紫外分光光度计测定溶液的吸收光谱，直至靛蓝吸收峰基本不再变化。为了考察部分降解的靛蓝溶液在黑暗条件下是否会继续降解，将自然光下放置5 d的不同质量浓度靛蓝标准品溶液，用黑色塑料袋包裹放置在柜子中模拟黑暗环境，间隔同样时间测试自然光和黑暗条件下放置的靛蓝标准品溶液吸收光谱。

1.2.2光照方式的影响 用手电筒白光(20 W)照射0.03 g/L的靛蓝标准品溶液，并测试在照射0、 5、 10、 20、 40、 60和70 min后的紫外吸收光谱；同样地，用手提式紫外灯(365 nm+254 nm)照射0.03 g/L的靛蓝标准品溶液，并在照射0、 1、 2、 3、 5、 8和10 min后测试溶液的紫外吸收光谱；另将0.03 g/L的靛蓝标准品溶液置于室外太阳光下照射1 h测量吸光度。

1.3 靛蓝提取物的制备

靛蓝膏在烘箱中80 ℃烘干，干燥后研磨成粉，过0.178 mm筛，得到靛蓝提取物1；靛蓝提取物1于水中均质后加盐酸，离心，下层固体用开水洗涤至中性并烘干，即得靛蓝提取物2；靛蓝提取物1和靛蓝提取物2分别经葡萄糖氧化还原提取得到粉末状靛蓝提取物3和靛蓝提取物4，靛蓝提取物1～4的靛蓝质量分数分别为6.6%、 28.22%、 50.91%和75.91%。

1.4 靛蓝提取物溶液的光氧化降解实验

1.4.1光照时间的影响 称取5 mg靛蓝提取物1粉末于100 mL容量瓶中，60 mL DMSO溶解后超声波处理30 min，冷却至室温后定容。用紫外-可见分光光度计在200～800 nm波段进行扫描。靛蓝提取物1溶液在室温下自然光的环境下放置，并在不同时间间隔下重复测量该溶液的吸光度。

1.4.2光照方式的影响 分别用手电筒白光(20 W)、手提式紫外灯(365 nm+254 nm)照射靛蓝提取物溶液，并测试在不同照射时间下的紫外吸收光谱。

1.5 分析方法

1.5.1靛蓝标准曲线的绘制 精密称取5.10 mg靛蓝标准品于100 mL容量瓶中，加入DMSO溶解后超声波处理30 min，冷却至室温后定容，配置成0.05 g/L母液，并稀释得到不同质量浓度(0.002～0.014 g/L)的靛蓝溶液。在紫外-可见分光光度计上用DMSO溶剂作空白对照，对不同质量浓度的靛蓝溶液在200～800 nm波长范围内进行扫描，由吸收光谱确定在可见光区靛蓝的最大吸收波长为618 nm。在618 nm的最大吸收波长处测定靛蓝溶液的吸光度，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，拟合得到的回归方程为：y=61.648 2x+0.001 4，R2=0.999 7。靛蓝在质量浓度为0.002～0.014 g/L范围内与吸光度的线性关系良好。

1.5.2降解率的计算 由于靛蓝的吸光度和质量浓度具有线性相关关系，故可以用618 nm处靛蓝吸光度变化值代表靛蓝降解的质量浓度变化值，靛蓝降解率计算公式如下：降解率=(初始吸光度-光照一定时间后吸光度)/初始吸光度×100%。

1.5.3HPLC分析 将白光照射后的靛蓝标准品溶液和靛蓝提取物溶液进行HPLC分析，并与靛蓝、靛红标准品溶液的色谱图对比。HPLC分析条件：PRAZIS C18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm)；流动相为甲醇/水(体积比70 ∶30)；流速1.0 mL/min；检测波长289 nm。

2 结果与讨论

2.1 不同条件对靛蓝标准品降解的影响

2.1.1光照时间 为了探究靛蓝在自然光下的稳定性，将不同质量浓度的靛蓝标准品溶液于室内自然光条件下放置不同时间，并测试其618 nm处吸光度的变化。基于不同质量浓度靛蓝标准品溶液在不同时间的吸光度值，通过指数拟合建立了靛蓝在618 nm处的吸光度-时间模型(图1)。由图可知，自然光下(图1(a)～图1(c))不同质量浓度靛蓝标准品溶液随时间降解曲线的拟合方程R2值均不小于0.997，而放置在黑暗条件下(图1(d)～图1(f))的靛蓝溶液随时间降解曲线的拟合方程R2值不小于0.990。故相比较而言，自然光下的靛蓝溶液吸光度值随时间呈指数变化更为准确。将在自然光下放置5天的溶液置于黑暗条件下(图1(d)～(f))，对比自然光下靛蓝溶液的降解曲线(图1(a)～1(c))，发现5～24天内黑暗条件下的对照样品会继续降解，但吸光度随时间下降幅度较小，且最终降解率较小。

自然光natural light: a.0.002 g/L; b.0.006 g/L; c.0.014 g/L

由图1可知，0.002、 0.006和0.014 g/L靛蓝溶液的吸光度值均在前5天明显降低，5～17天内缓慢降低，17天后逐渐稳定。而由图2可知，不同质量浓度靛蓝溶液的降解率不同，质量浓度较大的靛蓝溶液在相同时间的降解率更大，如24天时0.002 g/L靛蓝溶液降解率为95.63%，而0.014 g/L靛蓝溶液降解率约为100%。

图2 自然光条件下不同质量浓度靛蓝溶液的降解率Fig.2 Degradation rate of indigo solutions with different mass concentrations under natural light

同时，通过观察靛蓝溶液的颜色变化(图3(a))可知，自然光下放置3天靛蓝母液(0.05 g/L)就由深蓝色变为黄色，而放置相同时间的稀释得到质量浓度较小(0.002～0.014 g/L)的溶液颜色仍为蓝色，这进一步说明浓度越大的溶液降解速率更快。由图3(b)可以看出，在自然光下放置24天后的靛蓝溶液蓝色褪去，变为无色或黄色；而由图3(c)可知，在自然光下放置5天后，再置于黑暗条件下19天，累计放置24天后对照样品溶液仍为蓝色(母液除外)。且根据拟合的指数方程可知，与自然光条件下放置的溶液相比，相同质量浓度时黑暗条件下的靛蓝溶液拟合所得方程的指数项和指数前系数更小，这进一步说明部分降解的靛蓝溶液置于黑暗条件下降解速率会变慢直至稳定。

a.自然光natural light,3天3 days;b.自然光natural light,24天24 days;c.自然光5天+黑暗19天natural light,5 days+dark,19 days图3 不同光照条件下靛蓝溶液的颜色变化Fig.3 Color changes of indigo solutions under the different light conditions

2.1.2光照方式 由图4(a)可知，用手电筒白光持续照射靛蓝标准品溶液时，随着光照时间延长，靛蓝最大吸收峰(618 nm)明显下降且较低波长(400～450 nm)区域的吸收峰强度增加。在光照60 min时，618 nm处吸收峰完全消失，即靛蓝溶液完全降解。

a.白光white light; b.紫外光ultraviolet light; c.靛红标准品isatin standard; d.3种光照方式的对比three different illumination methods图4 不同光照方式照射不同时间后靛蓝溶液的吸收光谱Fig.4 Absorption spectra of indigo irradiated solution under different illumination methods

由图4(b)可知，当用紫外光照射靛蓝溶液时，可以看到溶液颜色逐渐由蓝色变为黄色，光照10 min时500 nm后吸收光谱区域无吸收峰，但400～450 nm左右区域的吸收峰增加。由图4(c)可知，光照处理后靛蓝溶液的吸收光谱与靛红标准品的谱图非常相似，故猜测靛蓝光照后谱图中400～450 nm区域吸收峰强度的增加可对应靛红含量的增加(418 nm)，初步证明光照后靛蓝溶液降解生成靛红。

经不同光照方式处理的靛蓝标准品溶液，在照射不同时间后，深蓝色靛蓝溶液均变为黄色。对比不同光照方式光照后靛蓝溶液的紫外吸收光谱(图4(d))，可以看出相同时间(60 min)的手电筒白光照射后光谱和太阳光照射后溶液吸收光谱重合性较好，故手电筒白光对靛蓝溶液的作用与太阳光作用相似。而紫外光照射后的溶液光谱吸收峰峰位和峰值与其他两种光照方式的溶液光谱均不同。这可能是由于紫外光能量高，使得靛蓝降解后产物进一步反应，引起的溶液降解反应比太阳光和手电筒白光的降解反应更复杂。因此，在实验室测量靛蓝含量时，靛蓝溶液配置后需避光放置，特别是避免紫外光照射，然后快速测量，否则靛蓝降解会造成测定结果偏低。

综上所述，手电筒白光、太阳光和紫外光照射都对靛蓝溶液产生了影响。由图5可知，不同光照方式下靛蓝均能完全降解，而能量较强的紫外光对靛蓝降解影响更大，照射5 min时降解率就已经达到100%。

图5 不同光照方式时0.03 g/L靛蓝溶液的降解率 图6 IE 1溶液的吸光度随时间降解曲线(618 nm)Fig.5 Degradation rate of 0.03 g/L indigo solution under different illumination modes Fig.6 Degradation curve of absorbance of IE 1 solution(618 nm)

2.2 光照时间和光照方式对靛蓝提取物溶液的影响

将靛蓝提取物1(靛蓝质量分数为6.6%)溶液于自然光条件下放置，测试不同时间下的吸收光谱并绘制降解曲线(图6)，发现溶液的吸光度值(618 nm)也是前5天下降较快，5～24天内缓慢降低，最后靛蓝几乎降解完全，变为无色透明溶液。靛蓝提取物在618 nm处的吸光度-时间拟合曲线R2值为0.998，靛蓝溶液吸光度值随时间呈指数变化。

将不同质量分数的靛蓝提取物2、 3和4溶液于自然光条件下放置，测试不同时间下的降解率，结果见图7。由图7可知，自然光条件下放置1天后靛蓝提取物4溶液的降解率约为98%，而13天后靛蓝提取物2溶液的降解率约为98%。靛蓝提取物溶液的浓度与所含靛蓝质量分数成正比，故浓度较大的靛蓝溶液在相同时间下降解率更大。由图8可知，用不同光照方式处理靛蓝提取物3溶液均能完全降解，而能量较强的紫外光对靛蓝降解影响更大，10 min内降解率达到100%。

图7 自然光条件下不同IE溶液的降解率 图8 不同光照方式下IE 3溶液的降解率Fig.7 Degradation rate of different IE solutions under natural light Fig.8 Degradation rate of IE 3 solution under different illumination modes

2.3 靛蓝标准品和靛蓝提取物溶液的HPLC分析

根据2.1节的分析可以初步判断靛蓝降解生成靛红，而HPLC图谱(图9)进一步证明靛蓝标准品和靛蓝提取物均降解生成靛红，并同时生成几种其他物质。根据靛红标准曲线计算得到，靛蓝标准品和靛蓝提取物降解生成靛红的比例分别为56.78%和85.50%，故靛红是靛蓝降解的主要产物[13]。

a.靛蓝标准品indigo standard; b.靛红标准品isatin standard; c.IE 3; d.靛蓝标准品白光照射后 indigo standard irradiated by white light; e.IE 3白光照射后IE 3 irradiated by white light图9 光照前后的靛蓝标准品溶液和IE溶液HPLC图谱Fig.9 HPLC spectra of indigo solution and IE solution before and after illumination

2.4 靛蓝光降解得到靛红的机理分析

Kuramoto等[16-17]认为单线态氧影响靛蓝的光降解，在靛蓝溶液中添加三乙烯二胺(DABCO)或二甲基二硫代氨基甲酸镍等单线态氧猝灭剂，可以降低靛蓝的光降解速率。近年来，Sousa等[13]研究发现在没有氧气的情况下，335 nm光或610 nm光照射下靛蓝的降解率仅为有氧气情况下的1/20，但靛蓝降解不是单线态氧引起而是氧基自由基或过氧化物自由基起到关键作用。Iuga等[18]通过密度泛函理论(DFT)研究了羟基自由基(·OH)和氢过氧化物自由基(·OOH)引发靛蓝氧化降解的量子化学机理。该研究从分子机制解释了·OH和·OOH攻击靛蓝中心双键，形成的中间体不稳定，迅速断裂生成靛红，从而导致染料褪色(图10)。反应加成产物的自旋密度在未取代侧分子周围离域，然后分子内重排、断键产生一个靛红分子和一个自由基，后者能与氧和靛蓝发生自由基链式反应，生成更多的靛红。Nassar等[2]将可以产生氢过氧化物自由基的双氟硼吡咯光催化剂(CAT)用于靛蓝降解，发现一个CAT分子可以使40多个靛蓝分子褪色；将自由基淬灭剂二叔丁基对甲酚(BHT)添加到靛蓝溶液中，靛蓝降解反应停止。综上，自由基是靛蓝光氧化降解的关键因素[2]。故应减少空气中易发生自由基反应的污染物或臭氧等对靛蓝溶液、靛蓝纺织品或绘画品的干扰。实验室中靛蓝溶液测试时应该使用新鲜溶剂，即新蒸或刚开盖的DMSO或DMF溶剂中由于含氧/水量较低，氧基自由基或羟基自由基含量相对较低，并避光，盖上瓶塞保持溶液密闭，通过多种措施减缓靛蓝光降解。

3 结 论

3.1在对靛蓝标准品溶液光降解影响因素进行考察的基础上，分析了靛蓝提取物溶液的光氧化降解。结果表明：在自然光条件下，不同质量浓度靛蓝标准品溶液在前5天降解最明显，17天后大部分靛蓝都已经降解(降解率>90%)，24天时达到稳定几乎不再降解。部分降解的靛蓝标准品溶液置于黑暗条件下降解速率会变慢，直至稳定。靛蓝标准品和靛蓝提取物溶液最大吸收峰位(618 nm)处吸光度值随时间均呈指数变化，均表现为浓度越高降解速率越快。

3.2HPLC分析结果表明：靛蓝标准品和靛蓝提取物降解生成靛红的比例分别为56.78%和85.50%，说明靛红是靛蓝降解的主要产物。

3.3能量较强的紫外光对靛蓝降解影响更大，紫外光照射使氧气生成活泼的氧自由基，氧自由基进攻靛蓝分子的双键，形成的不稳定中间体双键断裂得到靛红。为了减缓靛蓝的光降解，实际测量过程中靛蓝溶液应采取遮光、容器密闭、新鲜溶剂配置等措施，靛蓝染色纺织品、画作等文物在博物馆中展览也应该避免紫外光的干扰、保持干燥和防止有机化学污染物的接触，良好的环境更有利于文物的保护。