解偶联蛋白2的表达与结直肠癌患者临床病理特征和预后的关系

任燕珍, 李蕊仙, 陈建娥, 杜志超, 娄玉华

(内蒙古锡林郭勒盟中心医院, 1. 肿瘤科, 2. 药剂科, 3. 预防保健科, 内蒙古 锡林浩特, 026000)

近年来，结直肠癌的发病率呈逐年增长趋势，患者患病早期无法及时就诊是致死的主要原因[1-3]。线粒体解偶联蛋白之一的解偶联蛋白2(UCP2)是一种线粒体内膜蛋白，可以发挥介导离子渗透、影响ATP合成、参与体内脂代谢、调控细胞内活性氧(ROS)等多重作用。研究[4-5]已证实, UCP2可在多种肿瘤中均呈异常表达，其主要通过减少细胞凋亡、促进增殖等方式参与肿瘤的发生与发展过程。UCP2在结直肠癌中的表达与其临床病理特征和预后结局的关系尚不明确，相关研究较少。本研究通过免疫组织化学法检测结直肠癌及癌旁正常组织UCP2表达水平，探讨UCP2表达与结直肠癌患者临床病理特征、预后的关系以及预后的影响因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准: ① 符合临床结直肠癌的诊断标准者; ② 术后标本均通过病理诊断确诊为结直肠癌[6]者; ③ 术前采用放化疗治疗者; ④ 患者淋巴结转移、肿瘤直径等临床资料完整。排除标准: ① 有脑血管、心血管病、糖尿病以及肝、肾功能衰退等原发性疾病临床症状者; ② 患有老年痴呆症或者精神异常导致临床信息收集数据可信度不高者; ③ 有肿瘤症状的患者; ④ 有长期饮酒、吸烟等不良生活习惯并诱发肝脏功能衰竭者。根据随机抽样法以及纳入、排除标准，选取 2018年1月—2021年1月采用根治性切除术治疗的结直肠癌患者160例为研究对象。以世界卫生组织有关结直肠癌疾病诊断标准对患者进行诊断，参与实验的患者对本研究知情，研究经伦理委员会批准。结直肠癌患者中，男114例，女46例，年龄23～85岁，平均(60.33±4.55)岁。按肿瘤分化程度将其分为低分化患者50例和高分化患者110例。根据国际抗癌联盟(UICC)和美国癌症联合会(AJCC) 制定的TNM分期系统(2017年第8版), 160例患者中, Ⅰ期患者14例, Ⅱ期患者46例, Ⅲ期患者100例。84例淋巴结转移结果呈阴性, 76例结果呈阳性，患者体力未出现明显下降，生活可自理。剔除标准: ① 研究期间因工作调动等个人原因到其他省市生活、工作者; ② 自身出现严重疾病需转入其他科室进行进一步治疗者; ③ 不愿配合研究的患者。出现以上任意1种情况均纳入病例剔除范围，删除病例的相关资料，不再补充其他病例。直至研究数据收集完成，本研究未出现病例剔除情况。

1.2 方法

取所有研究对象手术切除的部分结直肠癌组织及其癌组织5 cm以外的癌旁正常组织送至相关科室检验。所有患者结直肠癌组织以及癌旁正常组织的标本均采用浓度为10%的福尔马林溶液进行固定，之后通过石蜡包埋以及制片等措施处理为厚度为4 μm的切片，分别进行苏木精-伊红染色(HE)染色以及免疫组织化学染色。从患者组织标本切片中选取4片进行染色, 1片用于HE染色, 3片用于免疫组织化学染色，并加入特异性单克隆抗体抗UCP2抗体。

1.2.1 HE染色: 将制成的切片利用二甲苯进行常规脱蜡，持续处理10 min, 并重复1次操作，之后按照100%、100%、95%、90%、85%的浓度分别进行酒精水化，每个浓度持续1 min, 之后利用自来水进行反复冲洗。应用苏木精染液对细胞核进行染色，持续15 min, 之后用自来水冲洗1 min。加入浓度为1%的盐酸酒精溶液进行细胞分化，持续反应20 s后置于自来水下冲洗1 min; 应用浓度为1%的稀氨水进行反蓝处理，持续30 s后置于自来水下冲洗1 min; 使用0.5%的伊红水溶液对胞质进行染色，持续3 min后脱水处理，按照85%、90%、95%、100%的浓度依序脱水，脱水时间分别为20 s、30 s、1 min、2 min, 每个浓度重复2次操作。使用二甲苯进行透明处理，持续2 min, 该操作重复3次后应用中性树胶进行封片，置于显微镜下观察。

1.2.2 免疫组织化学实验: 将制成的石蜡切片利用二甲苯进行常规脱蜡，持续处理10 min, 并重复操作1次，之后按照100%、100%、90%、80%、70%的浓度梯度进行酒精水化，每个浓度持续2 min; 采用双蒸水反复冲洗后使用免疫组化笔在切片上划取染色范围; 将浓度为3%的双氧水加至切片上，并在恒温环境中静置10 min, 以达到抑制内源性过氧化物酶活性的目的，并使用PBS溶液反复冲洗3次以上，每次持续2 min; 在pH值为6.0的枸橼酸盐缓冲液中放置切片, 95～98 ℃温度下微波炉加热，持续10 min后完成抗原修复，并在恒温环境中冷却20 min。加入正常山羊血清进行封闭处理，在恒温环境中静置15 min后丢弃山羊血清，注意不可冲洗，之后加入一抗，在37 ℃温度下进行孵育，持续15 min后利用PBS溶液反复冲洗3次以上，每次持续5 min; 加入辣根酶标记链霉卵白素，在37 ℃条件下进行孵育，持续15 min后利用PBS溶液反复冲洗3次以上，每次持续5 min; 各取1滴试剂盒中的A、B、C试剂，加入1 mL双蒸水，配置成底物染液DAB, 在切片上加上DAB, 直至出现棕色沉淀，使用双蒸水进行冲洗; 再次用苏木精溶液进行染色，自来水冲洗后进行脱水，按照70%、80%、90%、100%、100%的浓度梯度依序脱水，各浓度的脱水时间均为2 min, 每个浓度重复操作2次，之后使用二甲苯进行透明处理，持续1 min, 该操作重复2次后应用中性树胶进行封片，置于显微镜下观察。

1.2.3 免疫组织化学检测结果判定: 染色结果统一由2名具备多年免疫组化实验经验的临床医师进行评估判断，评判前不得向临床医师透露任何关于患者的病历资料, UCP2蛋白以细胞质作为主要分布区域，性状为棕黄色颗粒。临床医师根据统一的判定标准对染色结果进行评判，评判过程需重复3次以上。随机从高倍镜下选取10个视野，分别计数100个，应用精准度较高的半定量法完成该步骤，之后对染色结果中的阳性强度以及阳性细胞占比情况进行评分，具体评分标准如下。以背景色为参照评判阳性细胞的染色强度，无色记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分; 以阳性细胞占比情况进行评估，若结果为阴性则记0分，若阳性细胞占比为25%以下记1分，若阳性细胞占比为25%～50%记2分，若阳性细胞占比>50%～75%记3分，若阳性细胞占比超过75%记4分。将阳性细胞占比分值与染色强度分值相加，若总分值为≤1分则为阴性，用(-)表示; 若分值为2～3分同样记为阴性，用(±)表示，若分值为4～5分记为弱阳性，用(+)表示; 若分值6～7分记为强阳性，用()表示[7]。≤1分和2～3分均记为阴性, 4～7分均记为阳性。

1.2.4 随访方法: 对所有患者进行为期1年的随访，记录患者基因突变情况、化疗情况以及体力情况。

1.3 观察指标

① 比较UCP2在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达水平; ② 采用单因素分析探讨UCP2在结直肠癌组织中的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤直径、淋巴结转移情况等临床病理特征的关系; ③ 比较UCP2不同表达的结直肠癌患者的总生存率和无病生存率的差异; ④ 采用单因素分析探讨UCP2蛋白的表达与患者预后的关系; ⑤ 采用多因素Logistic回归分析模型分析结直肠癌患者预后的影响因素。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对实验数据进行统计学分析。绘制Kaplan-Meier生存曲线分析患者1年累积生存率; 采用多因素Logistic回归分析模型对总体1年生存率及预后危险因素进行评估分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 UCP2在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达

细胞质是UCP2蛋白表达的主要区域(图1), 免疫组化染色显示深浅不一，主要呈棕黄色或黄色颗粒，强阳性的细胞质中出现多处棕黄色颗粒，阴性细胞质中的棕黄色及黄色颗粒较少。UCP2在结直肠癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(χ2=158.505,P<0.01)。UCP2在癌旁正常组织中表达均为阴性, UCP2在结直肠癌组织中表达呈阳性106例(66.25%), 阴性54例(33.75%)。

A: UCP2在癌旁正常组织中阴性表达; B: UCP2在结直肠癌组织中阳性表达; C: UCP2在结直肠癌组织中阴性表达。图1 HE染色检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中UCP2的表达情况(放大倍数400倍)

2.2 UCP2在结直肠癌组织中表达水平对临床病理特征的影响

不同年龄、性别、肿瘤直径患者UCP2阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。低分化结直肠癌组织中UCP2蛋白表达水平高于高分化结直肠癌组织，差异有统计学意义(P<0.01); TNM分期为Ⅲ期的患者癌组织中的UCP2阳性表达水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，差异有统计学意义(P<0.01); 淋巴结转移患者癌组织中UCP2的阳性表达率高于淋巴结未转移患者，差异有统计学意义(P<0.01), 见表1。

表1 UCP2蛋白的表达与结直肠癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 UCP2蛋白表达与患者预后的关系

UCP2阳性表达的结直肠癌患者的1年总生存率、1年无病生存率低于UCP2阴性表达的结直肠癌患者，差异有统计学意义(χ2=8.12,P=0.03;χ2=9.55,P=0.03), 见图2、图3。

图2 不同UCP2表达的结直肠癌患者的1年总生存率生存曲线

图3 不同UCP2表达的结直肠癌患者的1年无病生存率生存曲线

2.4 UCP2蛋白表达与患者预后关系的单因素分析

单因素分析结果显示，不同肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴转移、UCP2表达的结直肠癌患者1年生存率比较，差异有统计学意义(χ2=6.13,P=0.01;χ2=40.80,P<0.01;χ2=7.01,P=0.01;χ2=8.12,P<0.01), 见表2。

表2 影响结直肠癌患者预后的单因素分析

2.5 UCP2蛋白表达与患者预后关系的多因素分析

将单因素分析中P<0.05的变量作为自变量代入结直肠癌患者预后结局的多因素回归分析模型中，肿瘤分化(0=高分化, 1=低分化)、TNM分期(0=Ⅰ期、Ⅱ期, 1=Ⅲ期)、UCP2表达(0=阴性, 1=阳性)、淋巴结转移(0=未转移, 1=转移)。预后1年生存率结果显示，结直肠癌患者预后结局的独立危险因素包括肿瘤分化(低分化)、TNM分期(Ⅲ期)、淋巴结转移、UCP2阳性表达, 见表4。

表4 结直肠癌患者预后临床因素的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

UCP2是一种阴离子转运体蛋白，分布于线粒体内膜，可以诱发质子渗漏并对膜两侧的电化学梯度造成破坏，进而降低线粒体膜电位，氧化磷酸化过程解偶联，抑制三磷酸腺苷的合成, UCP2在体内多种器官中广泛分布，其主要参与细胞生理进程[8]。多项研究[9-10]结果显示，头颈部、胰腺、前列腺与结直肠肿瘤中UCP2表达水平较高，易发生淋巴结转移。本研究免疫组织化学法结果显示, UCP2在结直肠癌组织、癌旁正常组织中阳性表达率存在显著差异，其作用机制如下。线粒体以氧化磷酸化方式产生能量，线粒体内膜上的ATP合酶是氧化磷酸化的关键，而UCP2作为一种阴离子转运体，可以跨线粒体内膜，无需通过ATP合酶途径回流，可以形成调控解偶联ATP生成与氧化磷酸化过程的质子漏，过程中释放的能量以热量形式散失，并未用于ATP合成过程，线粒体内膜电势下降、还原状态的中间产物时间缩短以及超氧阴离子生成率下降等现象均与UCP2介导质子引发渗漏有关联，进一步导致ROS生成率受调控呈负性增长，氧化应激反应减弱，增强肿瘤细胞缺氧、化疗药物耐受性，以此达到保护肿瘤细胞的目的，下调UCP2的表达可以抑制肿瘤的形成，提示UCP2在肿瘤的形成初级阶段可能扮演着极为重要的角色[11]。

本研究结果显示，低分化、TNM期为Ⅲ期、有淋巴结转移的结直肠癌组织中UCP2的蛋白表达水平更高，原因可能是UCP2参与肿瘤细胞的能量代谢，UCP2上调抑制线粒体氧化磷酸化过程，增强Warburg效应与促进糖酵解反应能量的产生，进而促进了肿瘤细胞的增殖和迁移，造成淋巴结转移、TNM分期增加以及分化程度降低等，进一步证实UCP2阳性表达可以发挥促进肿瘤转移的作用，同时也说明UCP2蛋白表达在肿瘤发展进程中具有显著作用[12-13]。

李秋妍等[14]在对乳腺癌进行临床研究时同样发现，UCP2的高表达与预后效果不理想有关。蒋滟蕲等[15]研究显示, UCP2 rs659366位点基因多态性可能是影响结直肠癌术后患者生存结局的因素，肿瘤部位(结肠、直肠)、TNM分期等与患者的生存结局相关，其机制可能是原发肿瘤浸润深度增加会使根治难度相应增大，而UCP2 rs659366位点A等位基因可以通过结合配对盒基因6(Pax6)增强启动子活性，促使UCP2转录过程加快，提高UCP2蛋白的表达水平, UCP2蛋白过表达会抑制结直肠癌组织产生ROS, 对部分通过ROS途径起效的药物的抗癌疗效造成影响，最终增大结直肠癌患者发生不良预后的风险。本研究还发现, UCP2阳性表达的结直肠癌患者的1年总生存率和1年无病生存率较低，不同肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴转移、UCP2表达的结直肠癌患者的1年生存率比较，差异有统计学意义(P<0.05); 多因素回归分析证明，肿瘤分化(低分化)、TNM分期(Ⅲ期)、UCP2阳性表达、淋巴结转移是影响结直肠癌患者预后的危险因素，分析原因可能是肿瘤容易侵及邻近组织并引发远处转移，肿瘤组织细胞间的黏附性减弱以及细胞运动、侵袭性能力增强会造成细胞的无限繁殖，增加氧气能量的消耗形成肿瘤组织低氧环境，增大肿瘤细胞转移复发以及病情恶化风险，导致组织低分化、TNM分期增加、淋巴结转移、UCP2高表达，进而增加死亡等预后不良风险。结合以上结果与UCP2的机制分析, UCP2有可能会作为媒介使肿瘤组织对化疗药物产生耐药性，因此肿瘤细胞UCP2高表达会降低患者对顺铂的敏感度，产生耐药性，进而降低化疗效果，不利于患者病情的控制，促进肿瘤患者病情快速进展，继而发生肿瘤组织低分化、淋巴结转移、TNM分期增加等，对患者预后不利，以上均证明UCP2阳性表达可能是结直肠癌患者预后不理想的危险因素, UCP2今后能够作为预测结直肠癌患者生存预后的重要标识。

综上所述, UCP2在结直肠癌患者癌症组织中呈高表达，与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移等存在密切关系, UCP2的高表达同时证明结直肠癌患者的预后效果不佳，可将研发UCP2的有效抑制剂作为治疗结直肠癌的新方向。