线粒体钠钙交换蛋白在心血管疾病发生发展中的作用研究进展

张晓静，李晓燕，成其发，常惠礼，陆婉霞，欧幸彤

1 广州医科大学附属第六医院清远市人民医院药学部，广东清远 511500；2 广州医科大学药学院

心血管疾病（CVDs）已为我国居民的首位死因，《中国心血管健康与疾病报告2020 概要》显示我国CVDs患病人数约3.30亿［1］。研究发现，线粒体结构和功能改变对调节心肌细胞代谢、促进CVDs 发展具有重要作用［2］。线粒体Ca2+（mCa2+）稳态由低亲和力的Ca2+单向转运蛋白（MCU）介导的Ca2+内流和线粒体钠钙交换蛋白（NCLX）介导的Ca2+外排组成，Ca2+内流和外排之间的平衡受损会导致mCa2+紊乱，进而引起疾病发生。因此，作为mCa2+的流出通道，NCLX 在调控mCa2+稳态中发挥重要作用［3］。NCLX由位于染色体12q24.13 区域的人类SLC8B1 基因编码，含584 个氨基酸，其结构包含13 个螺旋跨膜片段、7 个细胞内外拓扑异构结构阈［4］。NCLX 在心肌组织中含量较高，主要表达于心肌细胞、内皮细胞、混合免疫细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞，NCLX 蛋白在细胞质膜、线粒体膜和内质网膜中均有分布［5-6］。在特定环境下，NCLX 的电流具有双向性：①正向型，即mCa2+外排，这种功能对于舒张期Ca2+及时排出细胞、恢复静息电位非常重要；②反向型，即mCa2+内流，一些病理状态如缺血再灌注可导致反向NCLX 激活，促进线粒体对Ca2+的摄取，造成细胞内Ca2+超载［7］。NCLX 不具有Ca2+调节位点，NCXL的阳离子选择性和抑制敏感性明显不同于其余质膜钙钠交换体（NCX）家族成员［8］。本研究对NCLX 在CVDs 中的作用作一综述，为开发针对NCLX 调控mCa2+稳态的治疗策略奠定基础。

1 NCLX在心肌缺血再灌注（MIRI）中的作用

MIRI 发生过程中线粒体会产生大量活性氧自由基（ROS），启动氧化应激反应，导致线粒体损伤及细胞死亡，还会引起细胞内mCa2+超载，促进线粒体通透性转换孔（mPTP）开放，引起潜在的心室纤维性颤动等致死性心律失常和心力衰竭（HF）［9］。研究发现，在结扎左冠状动脉24 h的再灌注动物模型中，心脏组织NCLX 过表达可降低ROS 水平，并在左冠状动脉永久闭塞4 周后表达趋于平稳，有助于改善心肌细胞凋亡、纤维化和收缩功能障碍等［10］。研究还发现，抗凋亡基因Bcl-2 可通过影响NCLX 来调节mCa2+水平，以实现对心肌细胞的保护作用。ZHU等［11］研究表明，过表达Bcl-2的转基因小鼠心脏组织中NCLX 活性降低，mPTP 开放被抑制，同时伴随基质Ca2+水平、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）形成和丙酮酸氧化增强。

CRUZ 等［12］研 究 发 现，敲 除 调 控mCa2+转 运 的HeLa 细胞线粒体内膜基因SLP-2 会导致NCLX 活性增强，mCa2+排出速率增加，加入NCLX 抑制剂CGP-37157 后这种作用消失；同样，升高SLP-2 表达则会抑制NCLX 活性。因此，通过调控与NCLX 相关的基因或蛋白表达可影响MIRI的发展过程，并对心肌细胞产生良好的保护效益。研究发现，在离体兔心脏梗死实验中，缺血前或再灌注后分别给予心肌细胞膜上的阳离子转运蛋白NCX 抑制剂KB-R7943，同样可减少梗死面积，证明NCX 也是造成心肌梗死的原因之一［13］。

2 NCLX在肥厚型心肌病（HCM）中的作用

HCM 是一种以左心室肥厚为突出特征的原发性心肌病，是最常见的遗传性CVDs，也是导致CVDs患者发生HF 和猝死的主要原因。研究发现，心脏能量学和线粒体功能改变是HCM 患者常见的致病机制［14］。心脏不断地向全身泵送血液，是由ATP 水解所驱动的，在健康成人心脏中，ATP合成主要依赖于线粒体氧化磷酸（OXPHOS）。Ca2+可以激活OX⁃PHOS 中的丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）、异柠檬酸脱氢酶和2-氧戊二酸脱氢酶（OGDH），导致NADH在电子传递链中发生氧化还原反应，进而通过F1Fo ATP 合酶合成ATP。因此，作为决定mCa2+水平的NCLX在心脏能量学中具有重要作用。

研究发现，NCLX 抑制剂CGP-37157 可抑制应激诱导的mCa2+积累，并升高NADH 水平［15］。细胞质Na+含量增加也是HF 的生理学特征。研究发现，在β 肾上腺素能受体刺激主动脉收缩建立的豚鼠HF模型中，Na+指示探针SBFI 的激发光比率检测到细胞质Na+浓度为15 mmol/L，显著高于对照组的5 mmol/L，同时会导致mCa2+和NADH 水平增加；而加入NCLX 抑制剂CGP-37157 后，这些变化恢复到正常水平［15］。因此，NCLX 在HF 的病理过程中发挥重要作用，阻断NCLX 可能是一种治疗HF 的新策略［16］。

有研究通过Langendorff 灌注小鼠心脏，并采用23Na、31P、13C-NMR 和1H-NMR 等代谢组学分析，研究慢性和急性心肌Na+负荷对其能量学的影响；结果发现，抑制Na+-K+ATP 酶及慢性或急性超负荷诱导的心脏肥大均可导致细胞质Na+增加，并将氧化底物偏好从脂肪酸转变为碳水化合物，这是衰竭心脏中经常观察到的特征［17］。Na+升高通过影响依赖于Ca2+的三羧酸循环（TCA）脱氢酶活性，导致严重的代谢改变，如降低TCA 中间体代谢物水平等。使用NCLX 抑制剂CGP-37157 可将氧化底物偏好从碳水化合物转变为脂肪酸，并引起消耗的代谢物水平正常化，表明CGP-37157 在代谢重编程方面具有治疗潜力［17］。相反，在心脏特异性过表达NCLX 的小鼠中，并没有发现NCLX 对心脏能量学的不利影响［10］。

3 NCLX在糖尿病性心血管疾病中的作用

氧化应激是高糖引起内皮细胞损伤的重要机制之一。mCa2+是线粒体功能调控的关键因子，通过OXPHOS 产生ATP，与呼吸链电子传递和调控早期凋亡信号等密切相关。高糖诱导刺激可引起血管内皮细胞ROS 产生和激活NLRP3 炎症小体，导致线粒体功能紊乱，而过表达NCLX 对血管内皮细胞具有保护作用。研究证明，在早期糖尿病大鼠血管内皮细胞中，NCLX 表达升高有助于维持线粒体功能和稳定性［18］。研究还发现，抑制NCLX 表达可以增加mCa2+流入，阻止细胞去极化导致的葡萄糖依赖性胰岛素分泌延迟［19］。

4 NCLX在HF中的作用

HF是由各种原因所引起的心肌受损，导致心脏收缩与舒张功能发生障碍，心排出量不足以维持机体代谢需要的一种病理状态。研究显示，细胞能量代谢改变会伴随线粒体形态及功能受损，影响线粒体功能，造成细胞凋亡，从而诱发HF，HF 又可进一步导致mCa2+超载并导致病情加重［20-21］。mCa2+通过调节心肌细胞Ca2+稳态而维持心肌细胞功能的高效性，抑制mCa2+超载可有效减轻HF［22-24］。研究显示，在阿霉素诱导的大鼠HF 模型中，HF 大鼠NCLX 水平显著低于对照大鼠［25］。mCa2+超载介导的mPTP 开放和ROS 水平增加均与HF 密切相关。在他莫昔芬诱导的成年小鼠HF 模型中，敲除心脏中的NCLX 基因会引起小鼠猝死（只有不到13%的小鼠在14 d 后存活），其死亡原因可能与mPTP 开放和过量ROS 产生，引起心肌重构和心肌纤维化，从而导致严重的心肌功能障碍和暴发性HF 有关［22］。NCLX 过表达可增加心肌细胞对mCa2+的清除，但并不会影响mCa2+的摄取，同时可抑制mCa2+超载介导的mPTP 开放，从而预防或减轻缺血诱导的心肌细胞坏死和HF［10］。

但也有研究发现，理论上负荷增加会导致mCa2+增加减少、NADH 不足、OXPHOS 和ATP 产生减少，导致心肌细胞抗氧化能力降低；在衰竭的心室肌细胞中，升高的细胞质Na+通过NCLX 从线粒体释放Ca2+，引起ROS 水平显著升高，这可能是衰竭心肌细胞NAD（P）H 水平降低导致ROS 清除能力降低的原因之一，而加入CGP-37157 则可完全抑制ROS 的产生［26］。此外，在动物中长期给予CGP-37157 可改善肥大性重塑、间质纤维化、收缩功能障碍和心律失常等，有效防止动物发生HF［16］。HF 是MIRI 的一种危险并发症，心肌肥大以及左心室肥厚对HF 的发展起关键作用。研究发现，肥大的心肌组织功能障碍可能与细胞内Ca2+循环紊乱有关。洋地黄类因子激活NCLX 可能在HF 的发生发展中起着重要作用。KAMIMURA 等［27］研究发现，在洋地黄类因子诱导的Sprague-Dawley 大鼠HF 模型中，给予NCLX 抑制剂SEA0400 可抑制大鼠心脏成纤维细胞中H-脯氨酸的生成，减轻HF 大鼠左心室纤维化，从而提高大鼠的存活率。以上研究说明，NCLX 介导mCa2+外流对于维护心肌细胞内mCa2+稳态至关重要，是心肌细胞生存的基础，增加mCa2+外流可能是一种治疗HF 的新策略［10］。

5 NCLX在心律失常中的作用

心脏节律性是在心肌内以重复和稳定的方式发生的自发去极化和复极化事件，心功能不全或HF患者节律性通常异常或丧失。心律失常多伴随心肌传导性和兴奋性改变，是CVDs 患者的常见表现，而线粒体在心律失常的发生过程中具有重要作用，特别是线粒体能量代谢和氧化应激被认为是心律失常的常见原因［28］。研究发现，在小鼠心房肌细胞HL-1中，敲低NCLX 表达可以显著减缓细胞动作电位和Ca2+浓度瞬变的提高，并延长心动周期长度，但NCLX敲低并没有改变Indo-1最大荧光比值（反映细胞质Ca2+水平）［29］。咖啡因可以通过结合内质网/肌浆网（SR）的雷诺丁受体（RyR），或结合三磷酸肌醇，维持细胞内Ca2＋稳态。有研究使用荧光共振能量转移（FRET）蛋白Cameleon D1ER 进行实验，结果显示敲低NCLX 可降低咖啡因引起的SR Ca2+含量，并延缓SR Ca2+再摄取率；进一步分析表明，HL-1 细胞的自动性是由“Ca2+时钟”驱动，其中来自SR 的Ca2+泄漏，增强了内向电流，引起肌膜Na+-Ca2+交换并促进膜去极化；NCLX 敲低降低了mCa2+到SR 的转运，从而减缓了SR Ca2+泄漏，抑制通过肌膜Na+-Ca2+交换增加的内向电流，从而延迟电压依赖性Na+和Ca2+电流激活，导致循环长度延长［29］。以上研究证明，NCLX 可能与心房扑动和心房异位、心动过速等心房异常自律性有关。

此外，NCLX 功能异常还可能与室性心律失常有关。NCLX 敲低可引起由线粒体释放到细胞内的Ca2+减少，导致SR Ca2+释放和摄取降低，引起钙瞬变延迟和自发动作电位周期延长。在小鼠胚胎干细胞衍生的心室肌细胞及人类诱导多能干细胞衍生的心室肌细胞中，NCLX 活性异常参与了节律性改变［30］。此外，在他莫昔芬诱导的心脏特异性条件性NCLX敲除小鼠中，同样发生了QRS 间期延长的心律失常［10］。而NCLX 是否参与正常起搏细胞即窦房结（SA node）细胞的自律性目前仍不明确。研究发现，NCLX 抑制剂CGP-37157 可减慢兔和小鼠SA node细胞的放电速率；但是该研究对小鼠SA node 成像结果显示，有些SA node 单元只产生了肌浆网Ca2+释放（LCR），并没有产生动作电位诱导的Ca2+瞬变，有些只产生动作电位诱导的Ca2+瞬变，并没有产生LCR，还有一些在舒张期产生LCR，然后发生动作电位诱导Ca2+瞬变［31］。在他莫昔芬诱导成年小鼠3 天后，小鼠心脏组织中的NCLX 蛋白表达降低了70%，没有显示窦性节律改变［10］。

HAMILTON 等［32］研究证明，在大鼠心室肌细胞中NCLX 参与了ROS 产生、SR Ca2+处理和心律失常的发生，NCLX 抑制剂CGP-37157 可增强在异丙肾上腺素存在下由2 Hz 电流刺激触发的mCa2+蓄积，导致四甲基罗丹明甲酯（TMRM）荧光值增大，即线粒体膜电位去极化更明显。氧化还原传感器发现线粒体-SR 微区中ROS 和RyR 氧化增加，这种级联反应进一步加剧了由胸主动脉束带引起的肥大心脏中促心律失常的触发活动。25%的缺血性心律失常和75%的再灌注心律失常是由非折返机制［如延迟后除极（DAD）］引起的，当SR Ca2+释放发生在正常的兴奋—收缩耦联周期之外时，SR 释放Ca2+期间的内向电流（Ca2+流出）会导致延迟后去极化，引起心律失常。

综上所述，NCLX 可调节mCa2+外流，影响mCa2+稳态，导致线粒体功能和ROS 含量改变，在MIRI、HF及心律失常等CVDs 中均发挥重要作用。NCLX 可直接调节细胞质和线粒体中Na+、Ca2+浓度及膜电位，并可能通过不同调控途径平衡与ROS 的关系。因此，不同实验条件或疾病状态下的离子条件和线粒体活力差异会导致NCLX 的作用不同。现有研究发现，NCLX 在HF 中的作用不同，可能就是不同条件下的调控机制不同导致的，未来需进一步检测NCLX 过表达对HF 心脏mCa2+水平、细胞质Na+水平和代谢组谱的影响，确定是否存在代偿机制减少mCa2+内流。同时，NCLX 是否参与SA node 细胞的自律性仍不明确，应进一步研究NCLX 敲除小鼠SA node 的体内成像，阐明NCLX 在起搏活动中的定量作用。