基于GEO和TCGA数据库筛选恶性胸膜间皮瘤免疫治疗疗效预测关键基因

张明光，齐晓光，徐海军

恶性胸膜间皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）是恶性程度较高的恶性肿瘤之一，多数情况下确诊时已是晚期［1］，其主要的手段是内科姑息性化疗，目前一线化疗的中位生存期约为12个月，尚无标准的二线治疗方案［2］。探索新的治疗策略是MPM研究的热点问题之一。

最近研究显示，针对程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（recombinant cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4）通路的免疫检查点抑制剂在MPM中显示出较好的抗肿瘤活性［3-6］，但是这种显著的免疫治疗反应仅表现在少数MPM患者中，而从整体的MPM免疫治疗效果来看，总体的免疫治疗反应还是偏低一些［7］，如何更好地实现精准化的免疫治疗，需要进一步探索并阐明MPM中促使免疫治疗反应的机制。2018年7月至2020年7月，本研究基于此出发点，探索MPM中，免疫治疗反应组与免疫治疗无反应组之间表达谱的差异及其参与的生物学机制的不同，阐明免疫治疗中起关键作用的分子及其相关调控通路，而这对于更好地实现MPM的精准的免疫治疗具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 GEO数据获取及处理检索GEO数据库，检索关键词“恶性胸膜间皮瘤”“免疫治疗”“PD-1单抗”等，筛选其中以高通量测序为技术平台研究，只有GSE117358纳入研究，该研究中共24个恶性间皮瘤标本，标本品系为BALB∕c小鼠，鼠龄范围8～9周，性别均为雌性，治疗药物：抗程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）单抗及抗CTAL-4单抗；具体处理方案：小鼠皮下移植瘤第7天或第10天，当肿瘤约9 mm2时，腹膜内接受100 μg抗CTLA4和100 μg抗PD-L1的剂量，并加100 μL磷酸缓冲盐溶液。第2天和第4天，小鼠接受额外剂量的100 μg抗PD-L1；按照是否对PD-L1联合CTAL-4单抗是否有效分为两组，免疫治疗反应组和免疫治疗无反应组，其中每组各12个样本。

疗效评估判定标准：当小鼠的肿瘤完全消退并且在治疗后至少4周保持无肿瘤时，将其指定为应答者。如果治疗开始后4周内增长到100 mm2，则被指定为无反应者。肿瘤生长延迟或部分消退的小鼠被指定为中间反应者，并从分析中排除。

1.2 差异基因的筛选首先，从高通量基因表达数据 库（gene expression omnibus，GEO）官 网 下 载GSE117358的RNA表达谱矩阵，按照免疫治疗有无反应进行分组：免疫治疗反应组（12个样本）和免疫治疗无反应组（12个样本），两组患者共有39 637个基因，整理分组之后的表达谱矩阵以备研究；其次，应用R语言中DEseq2和limma软件包进行基因表达水平的标准化及显著性差异分析，设置差异基因的筛选条件为：差异倍数的绝对值＞1.5，且P＜0.01认为差异有统计学意义；最后应用R语言中ggplot2软件包进行绘制火山图展示差异表达基因情况。

1.3 差异基因GO功能注释及KEGG富集通路分析所有差异基因纳入分析，采用基因功能在线注释分析David工具进行下一步研究，包括基因本体论（gene ontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集信号通路分析。该部分的分析目的在于进行观察两组之间在生物学行为及信号通路之间的差异。最后应用R软件Hmisc、ggplot2软件包绘制排名前10的GO及KEGG通路气泡图。

1.4 PPI网络构建及Cytoscape软件分析免疫相关关键模块为了进一步分析差异基因表达蛋白之间的相互关系，采用String在线软件，分析差异基因表达的蛋白的，蛋白-蛋白互作网络，并下载String网站中的蛋白-蛋白互作网络TSV结果文件，从而进行后续关键模块及核心基因筛选研究。

为了进一步分析这些将蛋白-蛋白互作网络中免疫相关的起重要作用的关键模块，将下载好的蛋白-蛋白互作网络结果导入Cytoscape 3.7.1软件进行研究，剔除网络中的孤立节点，运用MCODE模块，进行重要模块分析。

1.5 关键核心基因的筛选为了进一步分析参加这些模块中的关键核心基因，运用运用Cytoscape中cytohubba软件，对这些蛋白-蛋白互作网络中进行关键核心Hub基因进行筛选。

1.6 TCGA数据库的整合分析考虑前面的机制探索为小鼠样本，为了进一步在人的胸膜间皮瘤中验证，采用UALCAN在线数据库（http：∕∕ualcan.path.uab.edu∕index.html），在TCGA数据库中进行整合分析，UALCAN是一个有效的癌症数据在线分析和挖掘的网站，主要是基于TCGA数据库中的相关癌症数据进行分析，可以对相关基因进行表达谱分析，生存分析等。

2 结果

2.1 两组之间差异表达基因分析结果显示，在免疫治疗反应组（12个样本）及免疫治疗无反应组（12个样本）中，共筛选出1 025个差异有统计学意义基因，相对于免疫治疗无反应组，在免疫治疗反应组中有782个上调和243个下调基因。火山图见图1。为了更加直观地展示基因表达差异有统计学意义，按照差异倍数log FC数值，对于两组差异基因表达情况进行排序，排序前20个差异表达基因，见表1。

表1 基于|Log FC|排序的前20个差异表达基因

2.2 差异基因参与GO功能注释及KEGG富集通路分析GO是基于大数据及生物信息学发展，通过对靶基因进行功能注释分析，进而揭示其生物学功能，其包括生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）三个部分。对这些差异基因进行GO功能注释，结果显示，这些差异表达基因的功能，在BP方面，主要参与了免疫系统激活、炎症反应以及正向调控T细胞的分化和增殖等方面；在CC方面，主要包括细胞质膜外侧面、膜型结构、膜的整体成分、等离子体膜以及原生质膜的组成部分等；在MF方面，主要参与了碳水化合物结合、细胞因子活性及信号传感器活动等方面（见图2A～2C）。在KEGG富集信号通路方面显示，这些差异表达基因富集通路主要集中在细胞因子受体通路、细胞黏附通路、T细胞受体通路及NF-kappa B信号通路等方面（见图2D）。

2.3 蛋白-蛋白互作网络及关键模块分析构建蛋白-蛋白互作网络，结果显示，在蛋白-蛋白互作网络中，共有节点数量为534，连接边数为1 997，平均节点度为7.48，平均局部聚类系数为0.439，期望边数为648，PPI富集P＜1.0×10-16。

为了评估这些蛋白-蛋白网络中，哪些分子模块可能在免疫治疗反应中起到更加重要的作用，采用Cytoscape中MCDOE进行关键模块筛选，根据节点度评分，分别列出节点度排名前3个模块，其中节点度评分分别为25.856、8.632和7.000，见图3。

2.4 蛋白-蛋白互作网络中关键核心基因分析基于EPC算法，计算排名前10的重要的核心基因：Tnf，Il6，Ptprc，Csf2，Cd86，Cxcl9，Sell，Cxcr3，Ccl2，Cd40。见图4。

2.5 TCGA数据库中关键核心基因整合分析为避免小鼠样本的局限性，本研究进一步在人的胸膜间皮瘤样本中进行验证和整合分析，结果显示，虽然在不同的病理类型的胸膜间皮瘤中，各个基因表达水平方面有一定的差异，但是本研究的一个重要结果显示，Tnf，Il6，Cd86，Cxcl9，Sell，Cxcr3，Cd40等疗效相关关键分子在肉瘤样胸膜间皮瘤中呈现高表达，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

MPM是恶性程度较高的肿瘤之一，因缺乏有效的治疗药物，5年生存率较低［8］。近年来随着免疫治疗在肿瘤中的应用，免疫治疗已经在肺癌、黑色素瘤、肠癌等多种肿瘤中显示了良好的前景［9-12］。目前已有研究表明，针对PD-1和CTLA-4通路的免疫治疗，在MPM中显示出可喜的进步［3-6］；免疫治疗在MPM的综合治疗中，正在成为一种很有希望的治疗策略。然而，免疫治疗在MPM中总体有效率偏低［7］，如何利用GEO数据库中肿瘤基因信息平台的支撑［13］、更好地提高免疫治疗在MPM的精准化治疗，是肿瘤个体化诊疗中迫切需要解答的问题［14］。本研究正是基于此理论基础和此临床问题为出发点，探索了MPM中免疫治疗疗效预测标志物，从而更好地实现更加精准化的免疫治疗。

结果提示，相对于免疫治疗无反应组，免疫治疗反应组相关差异分子更多参与了细胞因子受体、T细胞受体等相关通路，而这些通路已经被诸多研究证实在PD-1单抗等免疫治疗中起到了至关重要的促进免疫激活的作用，从而导致更好的免疫治疗反应。其可能的机制在于T细胞通路的激活，增加了肿瘤微环境中浸润性T细胞的数量，而浸润性T淋巴细胞的浸润与良好的免疫治疗反应呈正相关［15-17］，这一理论同样适用于MPM的抗肿瘤免疫反应，同时也在一定程度上支持本研究的结果。

本研究的一个重要发现在于，除了已经被证实的免疫反应调节的分子通路外，我们的结果还提示，在MPM中核因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）信号通路可能也与良好的免疫治疗反应相关，其可能的机制在于NF-κB转录因子在免疫系统中发挥了至关重要的作用，包括促进免疫系统的发展，先天和适应性免疫反应等生物学过程［18］，这或许可以在一定程度上解释，NF-kappa B信号通路在MPM的免疫治疗中与良好的免疫治疗反应有关的原因。

另外本研究为进一步探索参与免疫治疗调控的分子网络及其关键分析，进行了重要模块及关键分子分析，对MPM免疫治疗参与重要通路及其功能调节的关键基因研究结果提示，这些关键基因大致分为三类，一类是细胞表面共刺激分子，比如CD86、CD40和PTPRC等；另一类是细胞因子类，比如肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素6（IL-6）等；其他的还有趋化因子类，比如CXCL9、CXCR3及CCL2等。

关于细胞表面共刺激分子与肿瘤免疫的研究，多表达于树突状细胞、单核细胞、记忆T淋巴细胞、活化B淋巴细胞及活化T淋巴细胞等肿瘤免疫微环境中，尤其是CD86的发现，促使了CTAL-4单抗药物在成功研究，给肿瘤的治疗带来了新的希望。另外，已有多项研究在其他肿瘤中提示，细胞因子在肿瘤的免疫治疗中起关键的作用，从而调节肿瘤的免疫治疗反应。Tsukamoto等［19］研究发现在黑色素瘤中研究发现，以促炎细胞因子IL-6为靶点可以增强荷瘤小鼠的肿瘤特异性Th1反应和随后的抗肿瘤作用。IL-6阻断后上调了免疫检查点分子PD-L1在黑色素瘤细胞上的表达，研究提示IL-6在免疫治疗中起到了重要的调节作用。Yi等［20］研究发现，TNF可以调节T细胞共刺激分子免疫和促进CD4+和CD8+T细胞的终末分化，也提示TNF基因在抗肿瘤免疫中可能作为一个新的治疗策略；我们的研究提示，这些关键基因同样在MPM的免疫治疗中起到了重要的调节作用，与前期的在其他肿瘤中的研究结果相一致。

而本研究中，除了这些已经被临床应用中证实的免疫治疗相关的关键基因之外，本研究结果还提示，某些趋化因子在MPM的免疫治疗调节中发挥了重要的作用。Tokunaga等［21］研究发现，CXCL9及CXCR3等可以调节免疫细胞的迁移、分化和活化，从而通过旁分泌作用导致肿瘤抑制作用。Pascual-García等［22］亦研究发现，阻断CXCL9及CCL2，可以增加肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润，从而增强抗肿瘤免疫治疗。尽管这些还多数处于临床前研究，但是仍提示，趋化因子通过调节肿瘤免疫微环境中的免疫浸润细胞，从而调节抗肿瘤免疫治疗的反应，与我们的结果发现相一致。对这些趋化因子进行深入研究，有望为抗肿瘤免疫联合治疗的策略提供新的思路。

另外本研究的一个有趣的发现在于，这些关键疗效预测分子在不同病理类型的MPM中的表达谱是有差异的，在肉瘤样亚型的MPM中，Tnf，Il6，Cd86，Cxcl9，Sell，Cxcr3，Cd40等疗效预测关键分子呈相对高的表达，提示这一类的肉瘤样的MPM更可能从免疫治疗中获益，但是限于目前为TCGA中表达谱的研究，有待临床进一步研究证实。

本研究也有一定的局限性，是以小鼠为研究载体，探索免疫疗效相关标志物；但是检索GEO数据库，目前研究胸膜间皮瘤与免疫的疗效的研究中，标本目前只有小鼠来源的测序数据，但是，小鼠来源的标本受到的干扰因素更容易控制，反而避免了在不同人群样本中的影响或者其他混杂因素，因此，作为疾病的内在机制的研究，小鼠标本或许是一个很好的研究载体；而且结合既往研究，通过对小鼠样本的研究中，对于揭示人类的疾病机制研究中扮演了非常重要的作用，所以，这也在一定程度上奠定了本研究的理论基础。

综上所述，本研究通过GEO数据库分析，探索了MPM免疫治疗疗效相关分子及其参与调控的关键通路，进一步对于这些关键基因进行深入研究，有望为MPM更加精准化的免疫治疗提供预测分子标志物，同时为进一步开发新的药物靶点提供一定的理论基础。

（本文图1～4见插图1-5）