白藜芦醇通过调控微小RNA-574-3p对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖、炎症水平及氧化应激的影响研究

刘立栋，徐腊梅，高洁，李洁，邵英，田雄涛，刘晓宇

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要微血管并发症，是终末期肾脏疾病的主要原因之一［1］。目前，DN在糖尿病病人中占全球并发症的30%以上［2］，吸引了许多研究人员的目光。DN的特征是肾小球中细胞外基质成分的过量产生和积累，最终可能导致肾小球硬化［3］。众所周知，肾小球系膜细胞（mesangial cells，MC）在维持肾小球完整性方面起着重要作用，并负责细胞外基质的积累［4］。先前的研究表明，高葡萄糖诱导的MC增殖和细胞外基质积累是DN中最重要的病理变化，随着DN进程中氧化应激的长期激活和炎症反应的发生，可能进一步加重DN［5］。根据报道，白藜芦醇能以剂量依赖性方式降低链脲佐菌素诱导的大鼠胰岛素抵抗，并改善DN大鼠的肾脏功能和脂质代谢［6］。白藜芦醇可以减轻糖尿病小鼠的蛋白尿，降低丙二醛含量，同时增加锰超氧化物歧化酶（manganese-superoxide dismutase，Mn-SOD），抑制肾小球足细胞和肾小管上皮细胞的凋亡，从而改善糖尿病小鼠的足细胞损伤［7］。白藜芦醇通过自噬增加转录调节微小RNA（MicroRNA，miRNA）-18a-5p表达，改善DN［8］。越来越多的证据表明，miRNA在人的DN中起着重要作用［9］。其中miR-574-3p在DN病人中的表达下调［10］。然而白藜芦醇在DN中的功能机制是否涉及miR-574-3p仍未可知。因此，本研究旨在2019年1月1日至2020年6月1日调查白藜芦醇对暴露于高葡萄糖的大鼠肾小球系膜细胞（rat mesangial cells，RMC）的增殖、迁移、氧化应激和炎症反应的影响，并初步探索白藜芦醇的分子机制。

1 材料与方法

1.1 药品、细胞与试剂白藜芦醇（美国Sigma公司），RMC（武汉大学中国典型培养物保藏中心），Lipofectamine 2000、TRIzol（美国Invitrogen公司），miScript RT试剂盒和miScript PCR系统（上海Qiagen公司），anti-miR-574-3p、anti-miR-NC（上海GenePharma公司），噻唑基蓝四唑溴化物（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT；上海生工生物公司），白细胞介素（interleukin，IL）-1β酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（英国Abcam公司），丙二醛、乳酸脱氢酶（lactate dehydrofenase，LDH）检测试剂盒、蛋白质提取试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）。

1.2 细胞培养、分组与处理将RMC在含有5.3 mmoL∕L葡萄糖和10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中于37℃，5%二氧化碳和95%空气中培养。常规培养RMC，并根据不同的实验目的进行分组，共八组：（1）白藜芦醇作用实验：正常对照组（NG，葡萄糖浓度为5.3 mmoL），高糖组（HG，葡萄糖浓度为30 mmoL［11］），HG+低剂量组（葡萄糖浓度为30 mmoL，白藜芦醇浓度为5 μmoL），HG+中剂量组（葡萄糖浓度为30 mmoL，白藜芦醇浓度为10 μmoL），HG+高剂量组（葡萄糖浓度为30 mmoL，白藜芦醇浓度为20 μmoL［12］）。（2）白藜芦醇机制实验：HG+中剂量组（葡萄糖浓度为30 mmoL，白藜芦醇浓度为10 μmoL），HG+中剂量+anti-miR-NC组（葡萄糖浓度为30 mmoL，白藜芦醇浓度为10 μmoL，转染anti-miR-NC），HG+中剂量+anti-miR-574-3p组（葡萄糖浓度为30 mmoL，白藜芦醇浓度为10 μmoL，转染anti-miR-574-3p）。其中，葡萄糖和白藜芦醇的作用时间为48 h。RMC转染时，依照Lipofectamine 2000制造商（美国Invitrogen）的说明步骤，将anti-miR-574-3p及anti-miR-NC分别转染RMC，24 h后用葡萄糖和白藜芦醇继续处理48 h，即为HG+中剂量+anti-miR-574-3p组和HG+中剂量+anti-miR-NC组。

1.3 MTT检测细胞增殖RMC以5×103细胞∕孔的密度接种在96孔板中，并在完全DMEM中培养。当RMC汇合率为70%～80%时，根据“1.2”中八组进行分组及实验处理，处理结束后，将10 μL MTT溶液（5 g∕L）添加到每个孔中，然后孵育4 h。丢弃MTT溶液后，将DMSO加入每个孔中，并在室温下孵育10 min。最后，用酶标仪在490 nm的波长处测量吸光度OD值。

1.4 Transwell法检测细胞迁移收集“1.2”分组的八组RMC在无血清DMEM中悬浮，将1×105个RMC接种到Transwell上室，同时将含有10%胎牛血清的DMEM培养基放入下室。培养24 h后，将残留在上膜上的细胞丢弃，固定贴壁于膜下的细胞，用0.5%结晶紫染色。在显微镜下对3个随机视野进行了计数，其平均值作为细胞迁移数。

1.5 蛋白质印迹法（western blotting）检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p21蛋白表达使用蛋白质提取试剂盒从“1.2”分组的八组RMC中提取总蛋白质。然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。使用抗Cyclin D1抗体（1∶1 000），抗p21抗体（1∶1 000），抗β-actin抗体（1∶1 000）与膜4℃孵育12 h。随后在室温下将膜与结合HRP的二抗（1∶3 000稀释）孵育1 h。使用增强的化学发光试剂可视化印迹。

1.6 ELISA检测炎性因子IL-1β、TNF-α水平收集“1.2”分组的八组RMC培养上清液，使用商购的英国Abcam公司的ELISA分析试剂盒，根据制造商的说明检测培养上清液中IL-1β和TNF-α水平。

1.7 试剂盒检测氧化应激因子丙二醛、LDH水平收集“1.2”分组的八组RMC培养上清液，根据上海碧云天生物技术研究所的丙二醛、LDH检测试剂盒的说明步骤，通过比色法测定丙二醛、LDH水平。

1.8 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-574-3p表达“1.2”分组的八组RMC的RNA在TRIzol试剂中，严格按照美国Invitrogen制造商的方案进行分离。使用miScript RT试剂盒和miScript PCR系统根据上海Qiagen公司的方案进行反转录和PCR扩增反应。引物设计如下：miR-574-3p正向引物序列为5’-GAGGGACAGGCCTCCTTACTC-3’，反向引物序列为5’-GCTTGTGTCCGAAGGAACGGCC-3’；U6正向引物序列为5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物序列为5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’。扩增条件如下：93℃变性30 s，64℃退火30 s，73℃延伸40 s，总共34个循环，和72℃延伸8 min。使用ABI 7500荧光定量操作系统对实验结果进行了分析和比较。所有样品均一式三份运行，并使用2-ΔΔCt法计算miR-574-3p相对于U6的表达。

1.9 统计学方法采用SPSS 22.0软件用于数据的统计分析，符合正态分布的定量数据表示为xˉ±s。多组定量数据采用单因素方差分析的方法，多组之间两两比较采用LSD-t检验的方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度白藜芦醇对高糖诱导的RMC细胞增殖和迁移的影响MTT、蛋白质印迹法的结果显示，与NG组相比，HG组RMC细胞活性增强，Cyclin D1蛋白表达量升高，p21蛋白表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与HG组相比，HG+低剂量组、HG+中剂量组和HG+高剂量组RMC细胞活性均逐渐减弱，Cyclin D1蛋白表达量降低，p21蛋白表达量升高，细胞迁移数减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1，2；表1。

图1 各处理组RMC细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和p21表达变化

表1 不同浓度白藜芦醇对高糖诱导的RMC细胞增殖和迁移的影响∕xˉ±s

2.2 不同浓度白藜芦醇对高糖诱导的RMC炎症、氧化应激和miR-574-3p表达的影响ELISA、试剂盒的结果表明，与NG组相比，HG组RMC炎性因子IL-1β、TNF-α水平增加，氧化应激因子丙二醛、LDH水平同样增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与HG组相比，HG+低剂量组、HG+中剂量组和HG+高剂量组RMC的IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平均逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。qRT-PCR检测数据表明，HG组RMC中miR-574-3p表达量低于NG组，差异有统计学意义（P＜0.05）；HG+低剂量组、HG+中剂量组和HG+高剂量组RMC的miR-574-3p表达量均高于HG组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同浓度白藜芦醇对高糖诱导的RMC炎症及氧化应激和miR-574-3p表达的影响

表2 不同浓度白藜芦醇对高糖诱导的RMC炎症及氧化应激和miR-574-3p表达的影响

注：IL为白细胞介素，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，LDH为乳酸脱氢酶。①与NG相比，P＜0.05。②与HG相比，P＜0.05。

2.3 抑制miR-574-3p表达能逆转白藜芦醇对高糖诱导的RMC细胞增殖和迁移的影响qRT-PCR、MTT、western blotting的结果显示，HG+中剂量+antimiR-574-3p组RMC的miR-574-3p表达量比HG+中剂量组低，细胞活性、细胞迁移数、Cyclin D1蛋白表达量比HG+中剂量+anti-miR-NC组高，并且p21蛋白表达量比HG+中剂量组低，差异有统计学意义（P＜0.05）。但上述指标在HG+中剂量组与HG+中剂量+anti-miR-NC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3，4；表3。

表3 抑制miR-574-3p表达能逆转白藜芦醇对高糖诱导的RMC细胞增殖和迁移的影响

表3 抑制miR-574-3p表达能逆转白藜芦醇对高糖诱导的RMC细胞增殖和迁移的影响

注：p21为细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A，OD为光密度，p21为细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A，Cyclin D1为细胞周期蛋白D1。①与HG+中剂量组比较，P＜0.05。

图3 各处理组RMC细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和p21表达变化

2.4 抑制miR-574-3p表达能逆转白藜芦醇对高糖诱导的RMC炎症及氧化应激的影响ELISA、试剂盒的结果表明，与HG+中剂量组相比，HG+中剂量+anti-miR-574-3p组RMC中IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平在HG+中剂量组与HG+中剂量+anti-miR-NC组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 抑制miR-574-3p表达能逆转白藜芦醇对高糖诱导的RMC炎症及氧化应激的影响

表4 抑制miR-574-3p表达能逆转白藜芦醇对高糖诱导的RMC炎症及氧化应激的影响

注：IL为白细胞介素，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，LDH为乳酸脱氢酶。①与HG+中剂量组相比，P＜0.05。

组别HG+中剂量HG+中剂量+anti-miR-NC HG+中剂量+anti-miR-574-3p F值P值重复次数9 9 9炎性因子IL-1β∕（μg∕L）41.78±1.79 43.56±1.57 63.33±1.15①51.21＜0.001 TNF-α∕（μg∕L）24.00±1.08 24.78±0.78 42.33±1.55①77.50＜0.001氧化应激因子丙二醛∕（μmoL∕g）35.89±1.28 35.78±0.76 51.56±1.52①54.48＜0.001 LDH∕（U∕L）52.33±2.17 53.33±1.64 82.22±1.75①82.82＜0.001

3 讨论

DN是导致末期肾脏疾病的最常见原因之一，可导致糖尿病病人死亡。肾小球MC是一种肾脏固有细胞，越来越多的证据表明，MC异常增殖和迁移在肾小球损伤引起的肾小球性肾炎的发病机理中起作用［13］，并且它们与DN的发生和发展高度相关［14］。MC增殖的增加被认为是DN的重要特征［15］。已有报道证实，高糖刺激可增强MC的增殖［14-15］。过度的氧化应激和炎症反应是DN发病的关键致病因素［16］。DN早期某些炎性因子如TNF-α，IL-1β，IL-6的分泌失调，促进DN的发展［17］。氧化应激是导致DN发生的另一个重要因素。过度的氧化应激会激活凋亡信号通路，从而导致细胞损伤和死亡，这在DN的发病机制中起着至关重要的作用［15］。已有文献证明，高糖处理可诱导MC中氧化应激因子（如SOD、丙二醛）和炎性细胞因子（如TNF-α，IL-1β和IL-6）的产生［18］。因此，调节细胞增殖、氧化应激和炎症将是保护MC免受高糖损伤的重要方法，并可能增进对DN的发病机制和治疗方法的了解。本研究利用高糖损伤RMC，观察到高糖使RMC的细胞活性和迁移能力增强，并刺激炎性因子IL-1β、TNFα和氧化应激因子丙二醛、LDH的产生，与前述报道相符，表明成功建立高糖损伤RMC模型。

中药已在许多研究中广泛用于治疗和控制糖尿病及其并发症，例如DN，并且可能提供DN机制的见解，并成为药物的有益补充剂DN的治疗［19-20］。白藜芦醇是一种天然植物多酚，具有抗氧化，抗炎、抗糖尿病、保肝、神经保护和抗癌的特性［21］。先前的研究还表明，白藜芦醇可以减弱DN的进展，例如白藜芦醇通过减轻内质网应激保护肾小管细胞免受高糖诱导的DN细胞凋亡［22］。白藜芦醇可以抑制氧化应激介导的足细胞凋亡，而有效地减轻了DN的肾脏损害［23］。白藜芦醇可能通过激活AMPK，降低4E-BP1和S6磷酸化，发挥抗增殖、抗肥大作用，从而抑制DN的发生发展［12］。但是，其作用机制仍不清楚。与先前报道［24］的结果一致，本研究观察到，白藜芦醇一方面可缓解高糖诱导的RMC增殖，并观察到Cyclin D1蛋白的下调与p21蛋白的上调。另一方面，白藜芦醇减轻高糖诱导的RMC细胞中IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平。这些结果表明，白藜芦醇抑制了高糖刺激的RMC的增殖、迁移、氧化应激和炎症，与前人报道的白藜芦醇改善DN的效果［22-23］相吻合。

资料显示，白藜芦醇通过miR-30d-5p∕SIRT1∕NF-κB轴保护H9c2细胞免受缺氧诱导的凋亡［25］。白藜芦醇通过下调miR-34a，显著降低卵清蛋白诱发的哮喘小鼠血清和支气管肺泡液中的IL-5，IL-13和TGF-β，减轻肺部过敏性哮喘和相关炎症［26］。本研究假设白藜芦醇保护高糖损伤RMC的作用与miR-574-3p有 关。miR-574-3p是 卵 巢 癌［27］、食 道癌［28］、结直肠癌［29］等肿瘤的抑制剂，被报道在慢性中风的病人［30］中表达下调，可能作为疾病的可诊断或治疗靶点的miRNA。本研究以高糖损伤RMC模型，检测到高糖使RMC中miR-574-3p的表达显著下调，这与前人报道的miR-574-3p在DN病人［9］中低表达的结果吻合，提示miR-574-3p可能是DN进展的关键调控因子。而白藜芦醇能够显著提高高糖诱导后RMC中miR-574-3p的表达，并且，抑制miR-574-3p表达后，白藜芦醇抑制高糖诱导的RMC细胞增殖、迁移、炎症及氧化应激的影响被逆转。这些结果表明，miR-574-3p的上调可能是白藜芦醇保护MC免受高糖损伤的作用机制之一。

总之，本研究表明，不同浓度的白藜芦醇可以抑制高糖诱导的RMC增殖、迁移、炎症和氧化应激，机制与上调miR-574-3p表达有关。表明白藜芦醇可能成为DN治疗的有价值的药物。鉴于本研究体外实验的局限性，有必要在将来进行进一步研究，以了解miR-574-3p在DN中的详细作用。

（本文图2，4见插图1-1）

图2 各处理组肾小球系膜细胞细胞迁移情况（结晶紫染色×200） 图4 抑制miR-574-3p表达能逆转白藜芦醇对高糖诱导的RMC细胞迁移的影响（结晶紫染色×200）