芦丁通过抑制NF-κB信号通路缓解大鼠结肠炎的研究

郭建军，凌应飞，李强

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是以直肠和结肠的浅表性、非特异性炎症病变为主的肠道疾病，其患大肠癌的发生率明显高于一般人群。近年来，UC的发病率呈逐渐上升的趋势，已成为医学研究领域的热点［1］。目前溃疡性结肠炎的病因和发病机制尚未完全阐明，大多数学者认为是免疫、遗传、环境等多方面因素作用的结果。由于该病病程较长，易反复发作，临床上对该病的诊治较为困难［2］。当前西医药用于治疗UC的方法包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、抗生素等，这些药物虽有一定疗效，但长期大量服用会导致副作用，停药后易复发等问题［3］。有学者的研究结果表明，核因子κB（NFkB）信号通路的激活往往伴有肿瘤或炎症的发生，并起着至关重要的作用［4-5］。因此，抑制NF-κB信号通路，有利于UC的缓解。

芦丁（Rutin）是一种从芦丁中提取得到的黄酮类化合物，具有多种生物活性，例如抗氧化，抗炎，抗糖尿病，抗病毒，心血管保护等［6-8］。有研究报道，芦丁通过抑制病人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、C反应蛋白、脑钠尿肽等，进而起着保护心脏的作用［9］。此外，杨巧丽等［10］发现芦丁对大鼠佐剂性关节炎具有抗炎和改善肾脏功能的作用。Power等［11］的研究显示芦丁可减轻结肠炎的程度和组织损伤。褚旭芳等［12］发现芦丁可抑制肠固有层Th细胞的应答来缓解实验性结肠炎的病变。但芦丁在缓解UC中的研究较少，为此，本研究在2020年4—5月间探讨了芦丁对右旋葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的UC大鼠的治疗作用，为芦丁治疗UC提供参考。且本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂SD雄性大鼠购自斯贝福（北京）生物技术有限公司；DSS、芦丁（纯度为99%）、水合氯醛均购自Sigma-Aldrich（美国）；小鼠TNFα ELISA试剂盒购自Biolegend公司；小鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；髓过氧化物酶（MPO）试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒（BCA试剂盒）购自Thermo Fisher Scientific公司；核因子κB p65（NF-κB p65）、人磷酸化IκB激酶-α（p-IκBα）、IκB激酶-α（IκBα）、β-肌 动 蛋 白（β-actin）抗 体 购 自Cell Signaling Technology。

1.2 动物分组和模型建立50只雄性大鼠随机数字表法分为五组，每组10只。分别为对照组，模型组，芦丁组（20、40、80 mg∕kg）。大鼠用10%水合氯醛（300 mg∕kg）腹腔注射麻醉。起效后，以硅胶管轻插入其肛门处约8 cm，再向肠内缓慢推入3%DSS溶液0.25 mL。提尾倒置大鼠30 s，确保造模液在肠腔弥散分布。造模24 h后，芦丁组大鼠给予腹腔注射低中高浓度的芦丁。连续给药5 d后，脱颈椎法处死大鼠，收集大鼠结肠组织。

1.3 DAI检测指标在整个实验期间，每日观察并记录各组大鼠的一般情况，包括精神状况、活动、大鼠的粪便性状及便血情况，记录各组大鼠的生存率，并计算疾病活动指数（disease activity index，DAI）。DAI=（体质量下降得分+粪便性状得分+便血情况得分）∕3。评分参照DAI评分结果进行。见表1。

表1 溃疡性结肠炎大鼠DAI评分检测结果标准值

1.4 大鼠结肠组织MPO活性的测定收集各组大鼠结肠组织后，用生理盐水对结肠组织进行漂洗，以达到摒除其肠组织表面粪便、血液等黏附物。称取约50 mg结肠组织，加入匀浆介质制备成5%组织匀浆。按照MPO试剂盒说明书测定MPO活性。

1.5 血清TNF-α和IL-6水平测定称取20 mg各组大鼠结肠组织，用电动混匀器把结肠组织磨成匀浆，3 000g离心5 min，取上清液。按照ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠结肠组织匀浆上清液中TNF-α、IL-6的释放水平。

1.6 免疫印迹分析取各组结肠组织20 mg，加入200 μL组织蛋白裂解液，冰浴充分研磨后裂解20 min，在4℃、12 000g转速下离心10 min，取上清液，用BCA测定总蛋白浓度。30 μg上样，以10%的SDS凝胶分离，完成后转移至PVDF膜上。再用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗p65、p-IκBα、IκBα，4℃下孵育过夜，随后加入二抗，室温下孵育控制在1 h左右。然后用Supersignal West Pico系统显影。

1.7 统计学方法采用SPSS 19.0进行统计，计量资料以xˉ±s表示，采用one way ANOVA对多组间数据进行性比较检验，行LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芦丁对DSS诱导DAI评分的影响从造模开始后即对各组大鼠每日进行固定时间评估其DAI评分，结果见表2。模型组大鼠造模后出现排便次数增加，软便、水样便、大便隐血、血便等情况。芦丁组大鼠情况有一定的改善。第5天时，模型组DAI评分为（2.98±0.57）分，显著高于对照组的0分（t=16.53，P＜0.001）；而芦丁组（20、40、80 mg∕kg）的DAI评分［（1.97±0.46）、（1.38±0.38）、（1.09±0.39）分］显著低于模型组（2.98±0.57）分（t=4.36，7.39，8.65，均P＜0.001），并呈剂量依赖性。

2.2 芦丁对DSS诱导的MPO活性的影响与对照组（0.52±0.09）U∕g相比，模型组大鼠结肠组织中MPO活性（1.26±0.07）U∕g明显升高（t=20.52，P＜0.001）；而芦丁组（20、40、80 mg∕kg）MPO活性［（0.98±0.06）、（0.75±0.08）、（0.74±0.04）U∕g］显 著 低 于 模 型 组（1.26±0.07）U∕g（t=9.60，15.17，20.40，均P＜0.001），且高剂量组（80 mg∕kg）的MPO活性最低。结果提示，芦丁可以有效降低DSS诱导的大鼠UC中MPO活性的异常升高。

2.3 芦丁对DSS诱导的TNF-α和IL-6的影响采用ELISA法检测各组大鼠结肠组织中IL-6、TNF-α的水平。模型组中TNF-α水平［（5.19±0.93）μg∕L］显著高于对照组（0.36±0.07）μg∕L（t=16.38，P＜0.001）；芦丁组（20、40、80 mg∕kg）的TNF-α水平（4.26±0.87）、（3.75±0.72）、（3.16±0.52）μg∕L均显著低于模型组（5.19±0.93）μg∕L（t=2.31，3.87，6.03，均P＜0.05）。同样地，模型组中IL-6水平（6.54±0.85）μg∕L显著高于对照组（0.18±0.03）μg∕L（t=23.65，P＜0.001）；芦丁组（20、40、80 mg∕kg）的IL-6水平（5.12±0.93）、（4.28±0.72）、（3.72±0.65）μg∕L均显著低于模型组（6.54±0.85）μg∕L（t=3.56，6.41，8.33，均P＜0.05）。结果表明芦丁可以抑制UC大鼠局部结肠组织TNF-α和IL-6的水平。

2.4 芦丁对DSS诱导的NF-κB的影响最后，采用蛋白质印迹法研究了芦丁对DSS诱导的NF-κB信号通道的影响。DSS诱导可明显激活p-IκBα［对照组的（3.24±0.31）倍］和核p65［对照组的（2.64±0.25）倍］的表达（t=22.85，20.74，均P＜0.001），而芦丁（20、40、80 mg∕kg）处理可有效地降低p-IκBα［对照组的（2.76±0.24）、（2.43±0.22）、（1.16±0.09）倍］（t=3.87，6.74，20.38，均P＜0.05）和核p65［对照组的（1.74±0.21）、（1.46±0.14）、（1.25±0.11）倍］（t=8.72，13.02，16.09，均P＜0.001），且高剂量组（80 mg∕kg）时p-IκBα和核p65的表达最低。结果表明，芦丁可有效下调DSS激活的NF-κB信号通路。

3 讨论

DSS诱导结肠炎模型具有简单，快速，可重复性和可控性等优点，广泛应用在炎症性肠病的研究中，该模型能够模拟人UC，出现腹泻、血便、体质量减轻等症状［13］。本研究采用DSS诱导结肠炎模型，研究了芦丁对结肠炎的保护作用及潜在的机制，结果表明芦丁能有效抑制DSS诱导的结肠炎，降低MPO、TNF-α、IL-6水平，并抑制NF-κB信号通路的激活。

DAI评分是一种大鼠精神状况、活动、粪便性状及便血情况的综合评价指标，可反映结肠炎的状况。DSS诱导后，模型组DAI评分显著升高，而给予芦丁后，芦丁组（20、40、80 mg∕kg）DAI较模型组显著降低，且高剂量组（80 mg∕kg）的DAI评分最低。结果提示，芦丁可有效缓解DSS诱导的UC。MPO为血红素蛋白，是嗜中性多形核粒细胞功能活性及其状态的产物，可直接诱发MPO下的中性粒细胞浸润性改变［14］。我们的研究结果显示：模型组MPO水平显著高于对照组；而芦丁处理则可以有效地降低DSS诱导MPO的异常升高，且高剂量组（80 mg∕kg）的MPO活性最低。结果表明，芦丁可以有效抑制DSS诱导UC大鼠结肠组织MPO的活性。此外，DSS诱导大鼠结肠炎后，可引起TNF-α和IL-6等促炎因子大量释放［15］。TNF-α是炎症和免疫反应中的一种重要介质，由多种细胞分泌，包括脂肪细胞、活化的单核细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞和成纤维细胞［16］。IL-6作为网络中细胞因子的主产物，在提示急性炎症反应环节发挥了关键性作用，该指标水平的异常升高，诱导C反应蛋白和降钙素原的生成，促进炎症的发生和发展［17］。TNF-α和IL-6受NF-κB信号通路的调控，其水平异常升高将导致大鼠结肠组织发炎和损伤，严重可诱发结肠癌。本研究评估了芦丁对DSS诱导UC的TNF-α和IL-6水平，发现芦丁（20、40、80 mg∕kg）处理可以有效地降低结肠组织TNF-α和IL-6水平，且高剂量组（80 mg∕kg）的TNF-α和IL-6水平最低。结果表明，芦丁可有效缓解DSS诱导TNF-α和IL-6水平的异常升高。

NF-κB在炎症中负责调控炎症基因转录，为最重要的基因转录因子。NF-κB激活后，导致p65从细胞质进入细胞核中并发生易位，调控炎性细胞因子的分泌，同时NF-κB又被这些炎性因子进一步激活［18］。IκBα是NF-κB的抑制剂，刺激因子诱导IκB磷酸化，从而释放NF-κB，调节炎症介质的合成与释放［19］。有研究发现，UC病人肠上皮细胞和黏膜巨噬细胞中，活化的NF-κB表达明显增加［20］。因此，我们评估了芦丁对NF-κB信号通路的影响，以明确芦丁缓解UC的机制，结果显示：芦丁（20、40、80 mg∕kg）处理后p-IκBα和核p65的表达较模型组显著下降，且高剂量组（80 mg∕kg）时p-IκBα和核p65的表达最低。结果证实，芦丁可有效下调DSS诱导UC的NF-κB信号通路的激活。

综上所述，芦丁可有效缓解DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎的症状和炎症反应，其作用机制可能通过下调NF-κB信号通路实现。