一种改性复合胶原止血材料的制备及试验

王水文，邓厚斌，刘晓雯

(上海长征医院，上海 200003)

在进行手术时，有一个重要环节就是止血，止血对于患者的安危和手术的成功都起到了很大的作用[1]。在进行脑、脾、肾、肝等脏器手术，肿瘤等血管薄弱的病变组织手术，凝血机能异常患者的手术时，仅仅采用缝合、结扎、电烙等机械止血方法是不够的，还需要配合使用一些止血材料才能达到良好的止血效果[2]。

随着医学技术水平的不断进步，止血方法和止血材料都有了很大的发展，医用领域常用的止血材料有纤维蛋白胶，明胶海绵，凝血酶，氧化纤维素等[3-4]，这些材料与结扎、纱布等传统的止血方法和材料相比，止血效果明显更好，但是这些止血材料还是存在一些副作用和缺点，且止血速度不够快。纤维蛋白胶属于血液制品，有传播血源性传染病的风险，并且为了防止产生过敏反应或形成血栓不能直接注入血管内，另外纤维蛋白胶对于较大静脉出血、动脉出血的止血作用并不理想。使用明胶止血时，明胶很可能造成伤口感染，并且由于粘附力较差比较容易脱落，用在内脏止血时需要进行缝合固定，另外明胶海绵的止血作用需要依靠体内的凝血因子，所以如果患者存在凝血机制障碍时，用这种止血材料止血并不能起到良好的止血效果[5-6]。凝血酶尽管能够有效促进血小板的聚集，但是其价格较为昂贵。氧化纤维素具有酸性，容易引起神经纤维的变性，并且其具有很强大额吸水性，如果受潮了会对其止血作用造成影响。胶原止血材料则不存在这些缺点，其止血效果好，止血时间短，且没有明显的副作用，是一种非常理想的止血材料[7]。胶原能够减少血栓的形成时间，加速血小板的聚集，同时血小板在胶原的刺激下，会释放各种凝血因子等分泌物以及亚细胞颗粒，血小板所释放的凝血因子会附着在受损的血管上，对受伤血管进行堵塞，从而起到止血的作用[8-9]。但是只单独使用胶原对伤口进行止血，会因为较差的吸水能力影响血液浓缩效果，进而降低止血效率。所以现在使用的胶原止血材料都是和其他材料一起复合制备成的，由于钙离子具有较为简单的空间结构，能够很容易地控制和清除，并且钙离子浓度的升高有利于血小板的活化，而血小板的活化、粘附、聚集和血栓形成的过程均需要钙离子的参与。透明质酸是一种哺乳动物细胞外基质糖胺聚糖，透明质酸的水溶液具有较强的粘性，可以对体内分子和细胞的渗透起到控制作用，同时影响细胞的分化，同时其免疫原性低，显著降低异体反应和引发炎症的可能性，同时透明质酸还具有优良的生物相容性和生物降解性[10]。这里我们用氯化钙、透明质酸和胶原制备复合胶原止血材料，同时对其使用效果进行了研究分析。

1 复合胶原止血材料的提取、制备

1.1 胶原的提取

将5 g风干的牛跟腱剪碎，并溶于浓度0.5 mol/L的乙酸溶液，取胃蛋白酶2.5 g加入其中；之后将溶液搅拌均匀，使用离心机以4 000 r/min的转速进行离心，时间30 min。将上层清液取出，向其中加入50 mL质量分数20%的氯化钠溶液，同样以4 000 r/min的转速离心15 min。然后，取其沉淀物大概100 mL，加入400 mL蒸馏水，15 mL乙酸，放入透析袋里面，透析4 d，并且每天都要换水，进行透析；完成后进行冷冻干燥处理，保存备用。

1.2 胶原的制备

在0.5 mol/L乙酸溶液中溶入提取好的胶原冷冻产物，取透明质酸0.2 g后搅拌均匀， 然后将溶液中的气泡排出后倒入模具，控制溶液厚度1～5 mm，进行冷冻干燥处理，即可获得防粘连层。另外,再取相同质量的胶原冷冻产物，将其在质量分数0.3%的乙酸溶液中溶解，再向其中加入0.5 g甘油，氯化钙0.1 g，搅拌均匀后倒在防粘连层表面，即可获得厚度为2～10 mm的复合胶原止血材料(见图1)。取50 mmol/L碳化二亚胺的体积分数为95%的乙醇溶液，将冻干海绵浸入其中，常温浸泡4 h，让其反应完全后使用离子水冲洗后冻干，再用60Co对其进行辐照消毒，最后保存备用。

图1 复合胶原海绵止血材料Fig.1 Composite collagen sponge hemostatic material

2 试验材料与方法

2.1 试验材料

DMEM/F-12培养基、胎牛血清、苏木精、甲醛；伊红等组织切片、染色用试剂、L-929小鼠成纤维细胞，普通级健康成年雄性新西兰大白兔18只，质量约2 kg/只。

紫外分光光度计、冷冻干燥机、精密酸度计、电子天平、电热恒温鼓风干燥、多用振荡器、水平摇床、磁力搅拌器和扫描电子显微镜。

2.2 试验方法

2.2.1对复合胶原止血材料的细胞毒性进行检测

取3 cm×3 cm的复合胶原止血海绵浸入10 mL的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)低糖完全培养液；之后，在温度37 ℃的孵箱内孵育48 h。然后，取其上层清液，并进行2倍稀释。

按照相关规定进行细胞毒性检测。取L-929细胞，然后将其胰蛋白酶传代培养至第3代，细胞浓度4×107cfu/L铺板，每孔100 μL，将其分为3组进行培养。阴性对照组加入200 μL的细胞培养液，阳性对照组加入200 μL的质量浓度64 g/L的苯酚溶液，试验组加入200 μL复合胶原海绵止血材料浸提液。将3组进行细胞贴壁培养1、3和6 d后，向其加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min。用酶标仪检测在波长490 nm下的吸光值，并求平均值。在每孔中加入20 μL质量浓度5 g/L的噻唑蓝(MTT)，在温度37 ℃条件下孵育4 h，然后去除上层液体并控干，再向每孔中加入DMSO150 μL，均匀混合10 min。最后，对其进行吸光值测定，将测定的吸光值记作A值。

计算细胞的相对增值率，计算公式：

a=实验组A-阳性对照组A

b=阴性对照组A-阳性对照组A

细胞相对增值率=a/b×100%

经过计算后，如果相对增值率大于等于100%，表明材料的等级为0级，即材料没有细胞毒性，材料合格；如果计算结果处于75%～99%，表明材料等级为1级，即材料的细胞毒性极低，材料合格。

检测结果发现细胞培养2、4和7 d后，试验组的A值与阴性对照组比较差异显著(P>0.05)；与阳性对照组比较，其A值均高于阳性对照组(P<0.05)，具体结果如表1所示。

表1 MTT法检测复合胶原止血材料的细胞毒性Tab.1 MTT assay was used to detect the cytotoxicity of composite collagen hemostatic materials

由表1可知，在培养第2、4、7 d后的相对增值率分别为(98.0±8.2)%、(99.0±2.5)%和(96.0±3.4)%，表明该复合胶原止血材料的细胞毒性为1级，属于合格材料。

2.2.2对复合胶原止血材料进行体外凝血活性检测

选择BIC凝血指数做体外测试，取3只相同的烧杯，分别加入相同量的进口和国产止血材料，抽取200 μL家兔抗凝全血，向烧杯中缓慢滴入，再向其中加入浓度0.2 mol/L的氯化钙溶液20 μL；启动血液凝固，静止5 min，取去离子水25 mL加入3个烧杯中，保持37 ℃恒温条件下静止5 min，然后将溶液取出，再用波长540 nm的紫外分光光度计测量其吸光值。另外，取血液0.1 mL，用水稀释至25 mL，在540 nm波长下测定吸光度值，A值设定为参考值100。根据计算公式即可获得凝血数值BIC，BIC=100×样品A/参考A，凝血效果越好则凝血指数BIC的数值越低，将每个样品都进行5次检测实验。

结果发现，复合胶原海绵止血材料的体外凝血指数为18.28±52.145，进口止血材料和国产止血材料的凝血指数分别为23.145±1.142、3.126±2.275，表明复合胶原止血材料的凝血指数显著低于国产和进口止血材料，说明复合胶原止血材料的体外凝血效果更好。

2.2.3对复合胶原止血材料进行体内止血效果检测

选择18只新西兰大白兔，并随机分为3组，对这3组新西兰大白兔分别使用进口、国内止血材料和复合胶原止血材料。将新西兰兔麻醉后仰卧固定在手术台上，然后一层一层地将其腹部纵向切开，用无菌纱布将组织液和血液吸干。暴露出其肝脏部位，在其右中叶进行肝叶钻透，等待25 s，让其自由出血；然后将止血材料覆盖在钻孔上，并快速将已知质量的无菌纱布铺在止血材料上，再将铁片压在无菌纱布上，同时开始计时，每隔40 s观察1次；如果没有血液渗出了，表示血已止住，将时间记录下来，记作出血时间。最后，对纱布的质量进行称量，将纱布的质量差记作出血量。

以新西兰兔标准肝创模型中的止血时间和出血量作为考察指标，具体结果如表2所示。

表2 复合胶原的止血效果比较Tab.2 Comparison of hemostatic effects of composite collagen

由表2可知，相比国产止血材料和进口止血材料组，试验组的止血时间和出血量都明显更低(P<0.05)，且BIC测试结果与此次试验结果一致；试验组的各项指标与国产和进口止血材料组相比，其止血时间分别缩短了65.8%和27%，出血量分别减少了100%和25%，且差异均显著(P<0.05)。结果表明，复合胶原止血材料不仅能够显著减少失血量，还可大大缩短伤口的止血时间，具有很高的临床止血应用价值。

3 讨论

3.1 止血材料

根据相关数据显示，绝大部分创伤患者都由于失血过多死亡，所以现在急需一种快速有效的止血材料，医学家和材料学家们都在致力于研发出防粘连的新型止血材料[13]。如果止血材料在止血和防粘的同时，可以有效促进损伤组织的修复，那么将更加适合于临床应用[14]。传统的止血方法都有或多或少的缺陷，因此还需要进一步研究开发出新型高效的止血材料和方法，优良的止血材料需要止血迅速，并且无毒、无抗原性，对组织愈合不造成任何影响，同时不会增加感染风险，并且经济实惠[15]。现有的国内外止血材料都还没有达到这个水平，还需要科研人员的进一步开发研究。

3.2 胶原海绵止血材料

随着科学技术水平的不断提高，关于止血材料的研究也在飞速发展，也陆续研发出了多种不同的止血材料，目前常用的止血材料有氧化再生纤维素、胶原海绵、壳聚糖、可吸收明胶海绵等等。近些年来关于胶原蛋白止血材料的研究一直都是国内外的研究热点，并且取得了一定的研究成果，开发了诸如片状、粉状、棉絮状、海绵状及纤丝状等多种剂型[16-17]。海绵状的材料对于浅而宽的创面止血效果较好，而棉絮状和粉末状的材料对于深而窄的创面的止血效要更好一些。目前使用的胶原止血海绵多是通过冷冻干燥技术来制备的，其整体呈三维形态，表面结构完整，具有较好的止血效果，另外通过调节预冻温度，能够改变材料的孔径结构如图2所示。实现对材料微结构的控制[18]。当然，也有一定缺陷，胶原经过人工处理后，在后期的自然状态下很难保存，同时也会降低胶原的各项性能，因此近些年来由许多研究人员都尝试通过改性研究提升胶原的性能，希望将其各项性能进一步优化。

图2 一种具有孔隙大小自适应调节的胶原海绵Fig.2 Collagen sponge with adaptive adjustment of pore size

3.3 复合胶原止血材料的制备

目前胶原的提取方法有2种：一种是生物化学工程合成法；还有一种是生物材料提取法，生物材料提取法的技术路线已经相对成熟，比较常用的有碱法、酸法、酶法以及酶酸混合法等方法。酸法、碱法和酶法还存在一些缺陷，容易使胶原三螺旋结构破坏，使胶原产生少量的变性；酶酸混合法则可以改善单一方法中存在的问题，而且酶酸混合法提取出来的胶原纯度更佳。胶原都是从生物材料中提取的，会造成内部共价键的破坏，影响胶原材料的力学强度，会使得其更快的分解，因为需要用到交联剂[19]。物理交联尽管可以避免残留外源有毒试剂，但是物理交联法这种方法的交联不够彻底，交联度低，化学交联需要引入外源有毒试剂，交联后会有有毒试剂的残留，清除起来十分困难。

现有的且使用较多的都是一些高分子聚合物等物质与胶原复合而成的止血材料。但还是存在一些问题，比如韧性不太理想，胶原在吸收了血液后有可能和与其混合的其他材料形成相互影响，进而导致材料的止血效果减弱[7]。所以需要利用物理或者化学方法，使胶原材料与多种其他成分进行复合，制成新型的止血材料。透明质酸是类糖胺聚糖物质，在组织工程中的应用十分广泛。有学者交联了水溶碳化二酰亚胺与多孔的透明质酸/胶原复合膜，透明质酸和胶原之间由于碳化二酰亚胺的作用下可以形成酯键和酰胺键，进而达到交联的目的[20]。

3.4 复合胶原止血材料的应用

透明质酸可以控制胶原成纤维的形成，制备而成的胶原复合止血材料细胞毒性为1级，属于合格产品。观察发现复合胶原止血材料成疏松的多孔海绵状，其微结构均匀。通过对比与国产和进口止血材料，发现全血与复合胶原止血材料能够进行互相促进，促进形成交替而海绵状，与血液形成了良好的关系。在体内观察试验中，使用复合胶原止血材料后，肝缺损的止血时间和出血量都有了很大的改善，同时止血材料与伤口的粘附更加紧密，有效地避免了其他组织与伤口的粘连。综上所述，复合胶原止血材料具有良好的止血效果，解决了一些传统止血材料所存在的问题，其在医用领域中具有很高的应用价值。

3 结语

随着现代科学和医学技术的不断进步和发展，对止血材料的要求在不断提高，这就需要科研人员开发出止血效果更好的新型多功能止血材料，理想的止血材料首先需要具有优良的止血效果，同时没有明显的副作用，成本低廉容易获得。而复合胶原止血材料刚好符合这些要求，另外，胶原在体内可以自行降解，不需要另外拆除，使用起来十分方便。随着对复合胶原止血材料的进一步研究开发，相信其在医学领域的应用范围会越来越广泛。