河南主要水产养殖区鲤和斑点叉尾鮰气单胞菌药物敏感性检测

裴超，陈颖，尚胜男，李旭东，杨雪冰

（1.河南师范大学水产学院，河南 新乡 453007；（2.河南省水产技术推广站，河南 郑州 450008）

随着我国水产养殖规模的不断扩大和高密度养殖的发展，水产动物疾病的发生也在增加，尤其是细菌性疾病造成的水产动物损失约占全部病害损失的50%以上[1]。气单胞菌是一类革兰氏阴性直杆菌，广泛存在于水体、土壤等自然环境中[2]，是引起水产养殖动物细菌性疾病的常见病原，包括嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophilae）、维氏气单胞菌（A.veronii）、温和气单胞菌（A.sobria）、豚鼠气单胞菌（A.caviae）和杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）等，能引起鱼类败血症、肠炎、打印病、鳖类穿孔病和腐皮病等严重疾病，给水产养殖业造成重大经济损失[3]。目前主要还是靠抗生素和人工合成的抗菌药物治疗水产养殖动物细菌性疾病。但是长期应用某种特定的抗菌药物，极易引起病原菌对该种药物的耐药性，因此实时检测养殖区内病原菌耐药性的变化十分必要，有利于养殖者有针对性地选择病原菌敏感药物，达到理想的治疗效果[4-9]。河南省沿黄河地区包括洛阳、郑州、新乡、开封等地，是河南省池塘养殖的主要区域，主要养殖鲤（Cyrinus carpio）和斑点叉尾（Ictalurus punctatus）。本研究通过检测河南省沿黄河地区养殖鱼类体内气单胞菌耐药性的最新情况，并结合近几年的连续监测数据分析细菌耐药性的变化，可为该养殖区的合理用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试药物

采用南京菲恩医疗科技公司生产的药敏分析试剂板测试分离到的菌株的药物敏感性。供试药物为我国目前允许使用的主要水产抗菌类药物，包括恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲恶唑+甲氧苄啶（复方新诺明），药物浓度梯度如表1 所示。

1.2 菌株分离鉴定

2020 年4—10 月分别从河南省郑州市中牟县、荥阳市王村、洛阳市孟津县白鹤镇、洛阳市孟津县会盟镇、新乡市延津县和开封市龙亭区、开封市祥符区等养殖池塘采集黄河鲤，均重（1.15±0.53）kg，共48 尾），和斑点叉尾均重（0.83±0.46）kg，共71尾。体表用75%酒精消毒后，用灼烧过的接种环从肝脏和肾脏处穿刺，在LB 培养基上进行划线培养，28℃培养24 h 后，挑取单菌落至LB 培养基中，扩大培养后，继续用划线培养法纯化3 次。纯化后的菌体用细菌基因组提取试剂盒（TakaRa）提取DNA，采用16S rDNA 序列鉴定菌株种类。DNA 扩增正向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物5’-GGTTACC TTGTTACGACTT-3’。PCR 反应条件为：95℃5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1.5 min，33 个循环，72℃终延伸10 min。PCR 产物琼脂糖凝胶电泳确定片段大小符合预期后，送上海生工生物工程公司测序。测序结果进行BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索，通过序列比对结果确定菌株种类。

1.3 抗菌药物最小抑菌浓度的测定

采用药敏分析试剂板（南京菲恩医疗科技公司）测试药敏，试剂板中药物浓度设置如表1。挑取纯化后的单个菌落于5 mL 生理盐水中，制成OD625=0.5 的菌悬液，吸取200 μL 菌悬液加入无菌生理盐水中，至终体积为20 mL。混匀后每个微孔加200 μL，阴性对照孔加入200 μL 无菌生理盐水。放入28℃恒温培养箱中培养24～28 h 后读取结果。通过肉眼判定，试剂板孔底澄明孔对应的最低药物浓度即为药物的最小抑菌浓度MIC。能够抑制50%的菌株生长所需要的最小药物浓度即为该药物的MIC50；能够抑制90%的菌株生长所需要的最小药物浓度即为该药物的MIC90。每个菌株对各药物敏感性重复测试3 次，取一致性最高的结果为最终结果，若3 次测得的结果均不一致，则重复测3 次，直至取得一致结果。药物敏感性的测定以及耐药率的计算依据美国国家临床实验室标准化委员会（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）的标准进行判定[10]。数据结果采用SPSS 软件进行分析，每种药物从2016—2020 年的5 次测定作为一组数据，不同药物组之间进行比较。各组数据进行方差齐性检验和方差分析（Analysis of Variance,ANOVA）后，采用最小显著性差异法（Least-Significant Difference,LSD）比较不同药物组间MIC50、MIC90和耐药率的差异显著性。

表1 所使用的药物及药物浓度梯度设置Tab.1 The drugs and concentration gradient in the test

2 结果与分析

2.1 气单胞菌的分离鉴定

表2 气单胞菌分离株信息Tab.2 The information on the isolated Aeromonas strains

2.2 气单胞菌对抗菌药物的感受性

针对分离到的34 株气单胞菌，测定7 种水产常用药物对每株菌的MIC，然后根据各菌株的MIC分布，得到每种药物能够抑制半数菌株生长的最小抑菌浓度MIC50，和抑制90%菌株数的最小抑菌浓度MIC90。恩诺沙星和盐酸多西环素MIC50数值最小，均为0.78 mg/L，依次为氟苯尼考（1.56 mg/L）、硫酸新霉素（3.13 mg/L）、甲砜霉素（6.25 mg/L）；MIC50数值最大的药物为磺胺间甲氧嘧啶钠（512 mg/L）和复方新诺明（256 mg/L）。MIC90数值最小的药物为恩诺沙星、硫酸新霉素和盐酸多西环素，均为12.5 mg/L，其次是甲砜霉素和氟苯尼考，为200 mg/L，最大的是磺胺间甲氧嘧啶钠和复方新诺明，为512 mg/L。气单胞菌对磺胺间甲氧嘧啶钠耐药率最高，为58.8%；对甲砜霉素、氟苯尼考的耐药率也较高，分别为32.4%和29.4%；对复方新诺明和恩诺沙星的耐药率为23.5%和20.6%；对盐酸多西环素和硫酸新霉素最为敏感，耐药率分别为8.8%和11.8%。气单胞菌对各种抗菌药物感受性如表3 所示。

表3 气单胞菌对各种抗菌药物的感受性分布（n=34）Tab.3 The sensitivity of Aeromonas strains to antibacterial drugs

2.3 气单胞菌对抗菌药物感受性的年度变化

在2016—2020 年间，每年都对沿黄河养殖区的气单胞菌进行分离鉴定，并对各抗菌药物对气单胞菌的MIC50和MIC90进行测定，按年份的统计结果见表4，年度变化示意图见图1 和图2。恩诺沙星和甲砜霉素对气单胞菌的MIC50较低（分别为9.0和11.9）且呈现略微下降趋势,恩诺沙星MIC90相对稳定，维持在25 mg/L 左右；而甲砜霉素MIC90在2017 和2018 年从200 mg/L 下降到100 mg/L 后，在2019 和2020 年又回升到了200 mg/L；硫酸新霉素和盐酸多西环素的MIC50和MIC90在2018 年出现一个高峰值，均为100 mg/L；氟苯尼考的MIC50五年来相对稳定，保持在1.56 mg/L 到3.13 mg/L 之间，但是MIC90处于上升状态，增幅较大，从6.25 mg/L增加到200 mg/L；磺胺间甲氧嘧啶和复方新诺明的MIC50和MIC90一直处于较高状态，高于128 mg/L。各药物组的MIC50无显著差异性（P＞0.05），而甲砜霉素和氟苯尼考MIC90明显高于恩诺沙星、硫酸新霉素和盐酸多西环素（P＜0.05）。甲砜霉素和氟苯尼考之间，恩诺沙星、硫酸新霉素和盐酸多西环素之间无显著差异性（P＞0.05）。

图1 2016—2020 年抗菌药物对气单胞菌的MIC50Fig.1 The MIC50 of antibacterial drugs to Aeromonas from 2016 to 2020

图2 2016—2020 年气单胞菌对抗菌药物的MIC90Fig.2 The MIC90 of antibacterial drugs to Aeromonas from 2016 to 2020

表4 抗菌药物对气单胞菌的MIC 和耐药率年度变化Tab.4 The annual changing of antibacterial drugs MIC and resistance rate to Aeromonas

耐药率年度变化显示，在2016—2018 年，气单胞菌对硫酸新霉素、磺胺间甲氧嘧啶和复方新诺明的耐药率极高，在80%～100%之间，显著高于其他四种药物（P＜0.05），2019 年和2020 年气单胞菌对这三种药物的耐药率有所下降，但对磺胺间甲氧嘧啶仍有约60%的耐药性；气单胞菌对恩诺沙星和盐酸多西环素的耐药率在2018 年有明显升高，达到53.8%，之后呈下降趋势；气单胞菌对甲砜霉素和氟苯尼考的耐药率较为稳定，维持在20%～40%之间（图3）。硫酸新霉素、磺胺间甲氧嘧啶和复方新诺明三种药物之间，以及恩诺沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素四种药物之间，耐药率无显著差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 气单胞菌的分离

本文采用16S rDNA 序列测定的方法，分离和鉴定了沿黄河养殖区鲤和斑点叉尾体内的气单胞菌。从分离数量来看，维氏气单胞菌数量占80%，是目前鱼类体内的主要气单胞菌类型，这与已报道的其他地区的分离结果相类似，表明该菌是目前最流行的气单胞菌[11]。维氏气单胞菌是养殖水体中常见的条件致病菌，感染鱼体致病后可以导致鱼体出现体表出血、溃烂、鳍条腐烂、突眼、腹水等症状。鱼体中维氏气单胞菌的流行可能与养殖密度过高、过度投喂、水质恶化等因素相关。以往对水产动物病原的分离调查，常常以发病水产动物为主要研究对象，而发病以后再进行病原鉴定和药敏试验往往会花费较多的时间，耽误最佳的治疗时机。本研究分析了正常养殖鱼体中的气单胞菌种类，证明最常见的是维氏气单胞菌，这为平时做好有针对性的疾病预防和早期诊断治疗提供了参考依据。

3.2 药物敏感性变化分析

2020 年各菌株的MIC50结果显示，气单胞菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和盐酸多西环素较为敏感，这与已报道的其他地区气单胞菌的耐药性结果相一致[12-14]。氟苯尼考的MIC50数值较低且年度变化不明显，但MIC90明显升高，说明氟苯尼考对一部分菌株仍然十分有效，但是，正在有越来越多的菌株对氟苯尼考有了耐药性，耐药率的统计结果也显示近两年气单胞菌对氟苯尼考的耐药率较前几年有所上升，国内其他地区也存在类似情况。例如北京地区鱼源嗜水气单胞菌对氟苯尼考也存在耐药菌株，耐药率约为15%[15]。MIC90数据和耐药率结果显示，很大一部分菌株也已经对甲砜霉素产生了耐药性。气单胞菌对氟苯尼考和甲砜霉素耐药性的增加，可能是这两种药物平时养殖中常用，选择压力导致细菌产生了耐药基因并进行传播扩散。气单胞菌对抗菌药物的年度变化表明，恩诺沙星的MIC50和MIC90一直比较稳定，但数值偏高，因此气单胞菌对恩诺沙星的耐药率也较高，在2018年出现了一个约50%的耐药峰值；硫酸新霉素、盐酸多西环素、甲砜霉素的杀菌效果会有浮动变化，硫酸新霉素在2016—2018 年、盐酸多西环素在2018 年，抑菌效果很差，这可能与当年及之前年份较多的使用这两种药物有关，使细菌对这两种药物的耐药性出现了一个明显的升高。

本实验中大部分菌株对磺胺类药物不敏感，气单胞菌对磺胺间甲氧嘧啶和复方新诺明的敏感性较差，尽管近两年对这两类磺胺类药物的耐药率有所下降，但仍处于较高水平。北京、广州等地的鱼源气单胞菌也对磺胺类药物有很高的耐药性[10,16]，这表明气单胞菌对磺胺类药物的耐药性存在普遍性，这可能与平时养殖中长期大量使用磺胺类有关。

普查水产动物致病菌的耐药性有利于掌握水产动物致病菌对各种抗生素药物敏感性的变化，根据致病菌的药敏特性有针对性地用药，避免滥用药物，减少致病菌耐药性的产生，有利于减少鱼类体内的药物残留，维持水产养殖的可持续健康发展。本研究能为河南省内的水产养殖者，特别是缺乏细菌药敏检测条件的养殖地区合理使用抗菌药物提供参考，在选择用药时，恩诺沙星、氟苯尼考、盐酸多西环素、硫酸新霉素等为首选抗菌药物，尽量不要选择磺胺类药物。有检测条件的地区还是应该进行细菌药敏检测，根据检测结果再选择合适的药物，确保药物的使用合理有效。

3.3 结论

河南省沿黄河水产养殖区气单胞菌耐药率整体水平已经较高，尤其是对磺胺类、甲砜霉素、氟苯尼考等常用药物的耐药性，已经成为水产养殖病害防治过程中需要重点注意的问题。应继续进行水产养殖病原菌耐药性检测，指导养殖者用药，倡导生态养殖，减少抗菌药物的滥用和过度使用，保证科学合理的临床用药及水产品质量安全。