藏药八味秦皮丸的质量标准研究

张沙沙 达娃卓玛 兰 钧 达娃普尺 杨丽琼

西藏自治区食品药品检验研究院，西藏 拉萨 850000

八味秦皮丸(样品如图1所示)是由秦皮、针铁矿、志达萨增、多刺绿绒蒿、寒水石(制)、风毛菊、朱砂(制)粉碎成细粉，过筛，加入人工麝香细粉，混匀，制丸，干燥后所得，是藏区常用的藏药制剂，具有接骨、消炎、止痛的药效，临床用于骨折、骨髓炎的治疗[1]。现行质量标准为1995年版《卫生部药品标准藏药第一册》，其检验内容仅为性状描述和一项简单的理化鉴别，过于简单，不能满足现代藏药制剂的质量控制要求。为研制一种八味秦皮丸现代化质控标准，本研究在八味秦皮丸原质量标准的基础上，在查阅相关文献[2-24]，结合现代化生产工艺和临床用药情况，通过一系列探索研究实验，初步建立了秦皮、风毛菊、多刺绿绒蒿、针铁矿、寒水石、朱砂的显微鉴别方法，秦皮甲素、秦皮乙素、7-羟基香豆素的薄层色谱鉴别方法，朱砂和秦皮乙素的含量测定方法，更为全面地建立了八味秦皮丸的质控指标，为老百姓的安全用药奠定了基础。

图1 八味秦皮丸样品图

1 仪器与试药

1.1 仪器 正置光学显微镜(日本尼康，Nikon Eclipse E1000)，103B型四两装高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)，电子天平(AL104，瑞士Metter Toledo有限公司)，标准型超纯水机(WP-UPT-10，四川沃特尔水处理设备有限公司)，SENCO W201型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)，ZF-I型紫外灯分析仪(上海顾村电光仪器厂)，SP-Ⅲ型薄层条带点样器(上海科哲生化科技有限公司)，薄层层析硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司)；硅胶G板、硅胶GF254(青岛海洋化工厂分厂)，聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)，高效液相色谱仪(Waters 2695/2996)，0.45 μm微孔滤膜(上海泰坦科技有限公司)。

1.2 材料 八味秦皮丸(批号：17136A、16007A、16116A、16117A、16118A，来自西藏甘露藏药有限公司；批号：20170801、20170801-1、20170801-2、20170801-3、20170801-4，西藏那曲地区藏药厂)，秦皮、针铁矿、志达萨增、多刺绿绒蒿、寒水石(制)、风毛菊、朱砂(制)及人工麝香经西藏自治区食品药品检验研究院中藏药室副主任次旦多吉鉴定，处方中秦皮、朱砂符合《中华人民共和国药典》2015年版一部的要求，针铁矿符合《德庆藏药》的要求，寒水石和志达萨增符合《中华本草》藏药卷和《新修晶珠本草》的要求，多刺绿绒蒿、风毛菊符合《中华人民共和国卫生部药品标准》1995年版藏药第一册的要求。秦皮甲素(批号：110740-200405)和秦皮乙素(批号：110741-201708)购自中国食品药品检定研究院；7-羟基香豆素(批号：111739-200501，中国药品生物制品检定所)、木犀草苷(批号：2018012118)、木犀草素(批号：2017011016)和山奈酚(批号：2018050121)，均购自成都普思生物科技股份有限公司；甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、浓硫酸、高锰酸钾(分析纯，成都市科隆化学品有限公司);氯仿、无水甲酸(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司);硫氰酸铵(标准滴定液，批号：20200729D，深圳市博林达科技有限公司);甲醇(色谱级，Sigma-Adlrich公司);磷酸(AR级，成都市科隆化学品有限公司);超纯水(由实验室标准型超纯水机制备)。

2 方法与结果

2.1 八味秦皮丸的显微鉴别 秦皮：石细胞成群或单个散在，类圆形、类方形或不规则形，直径20～45 μm，孔沟明显[3-5]。铁针矿：深红色针状物多见[2-3]。寒水石：不规则块片无色[6]，有层层剥落痕迹。朱砂：不规则碎块或颗粒，暗棕红色，有光泽，边缘暗黑，较为多见[7]。结果如图2所示。

图2 八味秦皮丸粉末显微特征图

2.2 秦皮的薄层色谱鉴别 取本品粉末3.0 g，加95%乙醇40 mL，密塞，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇3 mL使溶解，作为供试品溶液。按照八味秦皮丸的处方比例称取除秦皮外的其余药材，同法制成缺秦皮的阴性对照溶液。另取秦皮甲素对照品、秦皮乙素对照品，加甲醇制成每1 mL含秦皮甲素0.25 mg、秦皮乙素0.5 mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液、阴性对照溶液各2 μL,对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸(8∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果如图3所示。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，斑点清晰，Rf值适中，分离度良好，且阴性对照在此位置无干扰。

从左到右依次为：阴性对照、自制样品、混标、供试品(16116A、16117A、16118A、17136A、16007A、20170801、20170801-1、20170801-2、20170801-3、20170801-4)

2.3 风毛菊的薄层鉴别 取本品粉末3.0 g，加80%甲醇30 mL，加热回流45 min，滤过，滤液浓缩至干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取7-羟基香豆素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液，吸取供试品溶液2 μL、对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(9∶6∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果如图4所示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点，斑点清晰，Rf值适中，分离度良好。

图4 风毛菊的对照品、供试品薄层色谱鉴别图

2.4 朱砂的含量测定 取本品粉末约1.0 g，精密称定，置50 mL小烧杯中，加入浓硫酸30 mL与硝酸钾2.8 g，加热使之消解，放冷，缓慢加水40 mL，冷却至室温，滤过，用约10 mL水冲洗烧杯与滤渣，合并滤液，并加1%高锰酸钾溶液至滤液显粉红色，再滴加2% 硫酸亚铁溶液至粉红色消失后，加硫酸铁铵指示液2 mL(加适量的硝酸使硫酸铁铵指示液的颜色由红褐色变为浅黄色)，用硫氰酸铵滴定液(0.1 moL/L)滴定。每1 mL硫氰酸铵滴定液(0.1 moL/L)相当于11.63 mg的硫化汞(HgS)。结果发现，该方法简便、易操作，重现性好，准确性佳，适用于八味秦皮丸中朱砂含量的测定。十批次样品的测定结果如表1所示，样品中HgS的含量均在70 mg/g以上，平均值为79 mg/g，占样品中朱砂理论值的84%以上，表明该方法准确度良好。基于八味秦皮丸的生产投料和生产工艺，结合《中国药典》中相关品种的HgS含量限值，最终，将八味秦皮丸中 HgS的含量下限定为75 mg/g，上限定为95 mg/g。

表1 10批次八味秦皮丸的朱砂含测结果

2.5 八味秦皮丸的定量测定

2.5.1 秦皮乙素对照品溶液的制备 取秦皮乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，作为秦皮乙素对照品溶液。

2.5.2 供试品溶液的制备 取八味秦皮丸样品，研细，取约1.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入65%甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，再称定重量，用65%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.5.3 阴性样品溶液的制备 按照八味秦皮丸的处方比例称取除秦皮外的其余药材，按照“2.5.1.2”项下方法制备缺秦皮的阴性对照溶液。

2.5.4 色谱条件 色谱柱：Waters Sun FireTM C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测器：二极管阵列检测器，流动相：甲醇(A)-0.5%磷酸溶液(B)以甲醇为流动相A，以0.5%磷酸溶液为流动相B，按表2规定进行梯度洗脱；检测波长为345 nm，进样量10 μL。在上述条件下，秦皮乙素的保留时间为9.528 min，供试品中检出与秦皮乙素对照品保留时间一致的色谱峰，目标峰分离度均>1.5，且理论塔板数均>4000，且阴性样品溶液对测定结果无干扰。结果如图5所示。

表2 梯度洗脱程序

A.秦皮乙素对照品;B.供试品;C.缺秦皮阴性样品

2.5.5 方法学验证

2.5.5.1 线性关系考察 取秦皮乙素对照品适量，精密称定，用甲醇溶解制成每1 mL含秦皮乙素0.2 mg的对照品储备溶液。精密吸取对照品储备液适量，以甲醇逐级稀释，得对照品溶液。上机后检测，记录HPLC色谱图，以对照品溶液浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。由表3和图6可看出：秦皮乙素含量在0～0.04 mg/mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数r2为0.9991。

表3 秦皮乙素线性关系考察

图6 秦皮乙素标准曲线图

2.5.5.2 精密度试验 精密称取八味秦皮丸粉末1.25 g(批号：16007A)，置于50 mL圆底烧瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，加热回流 1 h，提取完后冷却至室温，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀过滤，取续滤液作为供试品溶液，连续进样6次。记录HPLC色谱图，对秦皮乙素的峰面积进行积分，结果显示RSD小于2%，表明该方法精密度良好。

2.5.5.3 重复性试验 精密称取八味秦皮丸粉末1.25 g(批号：16007A)，平行制备6份样品，分别置于50 mL圆底烧瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，称定质量，加热回流1 h，提取完成后冷却至室温，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀滤过，取续滤液作为供试品溶液，上机检测。记录HPLC色谱图，对秦皮乙素峰面积进行积分，并计算含量，结果显示6份样品秦皮乙素含量的RSD小于2%，表明本实验建立的HPLC法重现性良好。

2.5.5.4 稳定性试验 精密称取八味秦皮丸粉末1.25 g(批号：16007A)，置于50 mL圆底烧瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞称定质量，加热回流1 h，提取操作完成后冷却至室温，称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试溶液，分别在静置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h后进样。记录HPLC色谱图，根据峰面积进行积分计算，结果显示秦皮乙素的分析结果RSD小于2%，表明供试品溶液的稳定性良好。

2.5.5.5 加标回收试验 精密称取已知含量的八味秦皮丸粉末1.25 g，共称取5份，分别置于50 mL圆底烧瓶中，每份精密加入秦皮乙素对照品溶液适量，按照“2.3”项下的方法制备供试品溶液，上机，测定。记录HPLC色谱图，对秦皮乙素峰面积进行积分，以下列公式计算平均回收率和RSD值，结果见表4。加标回收实验结果显示，该方法平均回收率为96.8%，均高于95%，RSD为4.65%，小于5%，表明该方法准确度良好。

表4 秦皮乙素加样回收实验结果 (n=5)

2.5.6 样品中秦皮乙素含量测定 取10批(批号信息见表5)八味秦皮丸样品，按照2.5.5项下的实验方法测定样品中秦皮乙素含量。结果见表5。

表5 样品测定结果

由上表可知，来自我区6家企业的10批八味秦皮丸样品中秦皮乙素的含测结果在0.0213～0.4262 mg/g之间，平均值约为0.21 mg/g。但企业A的5批样品中秦皮乙素含量较那区藏药厂的高，平均值为0.38688 mg/g，企业B的5批样品中秦皮乙素平均含量仅为0.025 mg/g。八味秦皮丸处方总量为1004 g，秦皮的处方量为200 g，为生粉入药，每1 g八味秦皮丸中含秦皮约为0.2 g。《中国药典》2015年版一部秦皮项下规定，按干燥品计算，含秦皮甲素和秦皮乙素的总量，不得少于1.0%，若全换算为秦皮乙素，则每1 g八味秦皮丸中含秦皮乙素不得少于2 mg。考虑到制剂生产过程中粉碎、烘干、泛丸等工序的损失，拟定从秦皮药材到制剂中秦皮乙素的转移率按80%计算，其限度理论值为0.16 mg/g。西藏B企业所生产的八味秦皮丸中秦皮乙素含量低于限度理论值近10倍，提示该企业秦皮的药材质量控制不严格或生产工艺存在问题，而西藏企业A所生产的八味秦皮丸中秦皮乙素含量均大于0.34 mg/g，为秦皮乙素限度理论值的2倍及以上，表明该家企业采用的药材来源和生产工艺稳定。目前，只有企业A生产的八味秦皮丸具有国药准字号，而且，近年市场统计数据显示，企业A的八味秦皮丸产品生产、流通批量较大，故制定限量时以企业A生产的八味秦皮丸中秦皮乙素含量作为主要参考依据，将其含量平均值(0.38688 mg/g)下调20%，即0.30 mg/g。

3 讨论

3.1 TLC分析 风毛菊的薄层色谱鉴别，相关文献[18-20]表明，7-羟基香豆素和东莨菪内酯为风毛菊的特征成分，故初步筛选上述两种成分作为风毛菊TLC分析的对照品，按照2.3项下的实验方法对样品中的风毛菊进行薄层色谱鉴别，结果显示，东莨菪内酯虽斑点清晰，但八味秦皮丸阴性对照(不含风毛菊)对其有明显干扰，而7-羟基香豆素不仅斑点清晰，且阴性对照无干扰，故将7-羟基香豆素作为风毛菊的TLC分析对照品。

1.阴性对照(不含风毛菊)；2.风毛菊对照药材；3.自制八味秦皮丸样品；4.供试品(批号：16118A)；5.7-羟基香豆素；6.东莨菪内酯

3.2 朱砂的含量测定 朱砂的主要化学成分为HgS，在八味秦皮丸的处方中，所占比例接近10%。朱砂本身是具有毒性的，使用量在一定范围内，才能起到良好的药效，而超过一定量后，会对人体产生毒副作用，造成不可逆转的损伤甚至导致死亡[21]，为保证八味秦皮丸的质量安全，故需测定该产品中朱砂的含量(以HgS计)。在查阅有关文献[22-24]的基础上，初步确定了朱砂的含量测定方法，拟定硫酸加入量为20 mL、30 mL、40 mL，采用单因素对比实验，以对样品的消解程度作为评价指标，从耗材节约和环保角度出发，确定硫酸加入量为30 mL，拟定硝酸钾添加量为2.0 g、2.2 g、2.4 g、2.6 g、2.8 g、3.0 g，以最终含测结果和消解液过滤后的外观为综合评价指标，最终确定硝酸钾加入量为2.8 g。

3.3 HPLC分析

3.3.1 检测波长的确定 通过DAD检测器在紫外光波范围内扫描可知，秦皮乙素的最大吸收波长为344.5 nm，综合考虑，将其检测波长确定为345 nm。

3.3.2 流动相的选择 在查阅有关文献[13-14]的基础上，结合《中国药典》2015年版一部中“秦皮”项下的含测方法，选定甲醇-0.5%磷酸水溶液(20∶80)为流动相等度洗脱、甲醇-0.5%磷酸水溶液(27∶73)为流动相等度洗脱、甲醇-0.5%磷酸水溶液(30∶70)为流动相等度洗脱、乙腈-0.5%磷酸水溶液(30∶70)为流动相等度洗脱、乙腈-0.5%磷酸水溶液(50∶50)为流动相等度洗脱、甲醇-0.5%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，通过对比目标峰的分离效果和峰面积大小，最终选定甲醇-0.5%磷酸溶液为最佳流动相，洗脱方式见表2。

3.3.3 样品提取时间的选择 经查阅相关文献[15-17]，确定以甲醇为提取溶剂，以加热回流为提取方式，选定0.5 h、1 h、1.5 h、2.0 h四段加热回流时间对样品进行提取，通过对比实验结果发现，加热回流1 h时，样品中秦皮乙素的提取率较高，随着加热回流时间的持续增加，样品中秦皮乙素的提取率几乎无变化，表明样品中的秦皮乙素已被完全提取出来，从节约试剂耗材角度出发，将样品的提取时间定为1 h。

4 小结

本研究通过一系列探索实验，结合八味秦皮丸功能主治及质控需求、处方药材的采收情况等因素，初步建立了秦皮、铁针矿、寒水石、朱砂的显微鉴别项、秦皮和风毛菊的TLC鉴别项、朱砂(HgS)和秦皮乙素的含量测定项，并基于八味秦皮丸处方，结合生产工艺和药材活性成分转移率，初步制定了朱砂和秦皮乙素的含量限值。通过一系列方法学验证实验表明，该质控方法专属性强、重复性好，简单易操作，可作为藏药八味秦皮丸的质量控制依据。