HPLC法测定壮西-11中大黄酚含量

秦 丹

呼伦贝尔市食品药品检验所，内蒙古 呼伦贝尔 021000

蒙药壮西-11是在壮西-10丸基础之上改进工艺，由奶制红石膏、大黄、土木香、木香、诃子等十一味药材组成的复方制剂[1]。具有消瘀、散结、理气、通脉、消炎的作用，用于月经不调、气瘀、血瘀症、盆腔炎、附件炎、膀胱炎等。方中君药为奶制红石膏，指标成分不易控制，故选用臣药大黄作为指标成分[1]。大黄为蓼科植物掌叶大黄(RheumpalmatumL.)、唐古特大黄(Rh.tanguticumMaxim.ex Balf.)或药用大黄(Rh.officinaleBaill.)，具有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄之功效[2]。现代研究证明，大黄药理活性的主要成分为蒽醌类、蒽酮类、鞣质、多糖等报道较多[3-4]。大黄蒽醌类衍生物主要包括芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚及大黄酸[5]。在壮西-10丸研究基础之上，本制剂选择大黄酚作为质量控制指标，并建立了测定壮西-11中大黄酚含量的高效液相色谱方法，专属性强，更便于产品的质量控制。现将实验报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2695型液相色谱仪(2998 PDA Detector)、 UV-2450型紫外-可见分光光度计(岛津仪器有限公司)。Sartorius BSA224S和BT 125D型电子天平，数显恒温水浴锅，KQ-500DE型数控超声波清洗器。

1.2 材料 大黄酚对照品(批号：110796-201922，纯度99.4%)由中国食品药品检定研究院提供；壮西-11由内蒙古自治区国际蒙医医院提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验 参照2020年版《中国药典》一部“大黄药材含量测定”项下含量测定方法，最终选定的色谱条件为色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液(90∶10);检测波长：254 nm；流速：0.8 mL/min;进样量10 μL;柱温：30 ℃，理论塔板数不低于3000[2,6]。色谱图如图1、图2所示。

图1 对照品溶液高效液相色谱图

图2 供试品溶液高效液相色谱图

2.2 溶液制备方法 对照品溶液：取大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL约含0.1 mg的溶液，即得。供试品溶液：参照2020年版《中国药典》一部“大黄药材含量测定”项下含量测定方法，将本品研细取约1.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加入10 mL盐酸溶液(8%)，超声处理2 min，再加入三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，取出，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，分取三氯甲烷层，剩余酸液再用三氯甲烷提取4次，10 mL/次，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[2,7]。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取大黄酚对照品约2.36 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀(0.0938 mg/mL)。精密吸取对照品溶液适量，以甲醇稀释配制成质量浓度为2.814 μg/mL、3.752 μg/mL、 5.628 μg/mL、6.566 μg/mL、7.504 μg/mL的系列溶液。按上述色谱条件，以对照品溶液质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，测得线性回归方程Y=74220X-7454(R2=0.9997，n=10)。结果表明大黄酚质量浓度在2.814～7.504 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 取大黄酚对照品溶液，重复进样5次，记录峰面积，计算RSD值为1.23%，表明仪器精密度良好。结果见表1。

表1 精密度试验结果表 (n=5)

2.3.3 重复性试验 制备供试品溶液，平行6份，记录峰面积，结果样品中大黄酚含量的RSD值为1.8%，显示方法重复性良好。结果见表2。

表2 重复性试验结果

2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0 h、2.5 h、5 h、7.5 h、10 h、12.5 h、15 h依次进样测定，结果大黄酚峰面积的RSD值为0.74%。结果表明：供试品溶液在15 h稳定性良好。结果见表3。

表3 供试品溶液稳定性考察结果

2.3.5 加样回收试验 取本品(大黄酚含量为0.216 mg/g)9份，每3份为1组，每一组精密加入大黄酚对照品溶液(0.1014 mg/mL)1 mL、1.3 mL、1.6 mL，制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果表明，大黄酚的加样回收率结果良好。结果见表 4。

表4 大黄酚加样回收试验结果

2.4 样品含量测定 分别取3批壮西-11各约1.2 g，进样测定并记录峰面积，计算制剂中大黄酚的含量，结果见表5。

表5 三批壮西-11中大黄酚的含量表

3 讨论

3.1 流速考察 在流速分别为0.8 mL/min、1.0 mL/min，其余色谱条件不变，对供试品溶液进样考察。结果表明，供试品溶液中的大黄酚色谱峰在上述两种流速下均能较好分离，但随着试验的进行，流速为1.0 mL/min时柱压偏高，0.8 mL/min，柱压相对理想，且含量无明显差异，选择流速为0.8 mL/min。

3.2 提取效率的考察 试验中考察了甲醇加热回流30 min、60 min、90 min不同提取时间对提取含量的影响，结果表明甲醇加热回流提取60 min，大黄酚的含量基本稳定不变，且高于加热回流提取30 min及90 min时，故选择甲醇加热回流时间为60 min。

3.3 萃取次数的考察 试验中考察了三氯甲烷提取次数：2次、3次、4次、5次(10 mL/次)对提取含量的影响，结果表明三氯甲烷萃取5次与4次含量基本不变，且含量高于萃取3次，故选择萃取次数为4次。

3.4 色谱柱考察 选用不同的色谱柱(SHIMADZU Shim-pack GIST C18，SHIMADZU-GL WondaCract ODS-2)对供试品溶液进样考察。结果表明，分离度、理论塔板数均能够满足要求，说明耐用性较好。

本试验采用HPLC法对壮西-11中的大黄酚成分开展了方法学考察，建立了高效液相色谱方法，通过对三批样品含量的测定进一步验证了大黄酚含量测定的稳定性。该方法简便易操作，灵敏度和准确度较高，稳定性试验、重复性试验及加样回收试验都理想，可以用于壮西-11中大黄酚的含量测定及质量控制。