单细胞转录组测序在年龄相关性黄斑变性研究中的应用

安 宁，张福燕，秦 波

0引言

细胞在多次分裂增殖期间发生分子生物学或基因的改变，产生细胞状态或类型的多样性，这种多样性被称为细胞异质性，普遍存在于多细胞生物个体中。传统的测序方法忽视细胞异质性，只能反映细胞群体的平均差异，而单细胞技术可揭示细胞间异质性，在更深层次上探究生命活动的本质和规律。2013年单细胞测序技术被Science评为年度最值得关注的六大领域榜首，NatureMethods将该技术评为2013年度最重要的方法学，2015年再度登上ScienceTranslationalMedicine封面，2018年单细胞转录组测序(single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq)被Science评为年度突破技术，2019/2020年单细胞多组学和单细胞空间转录组测序再次评为年度技术，成为最值得期待的生物技术之一。scRNA-seq在单细胞水平对转录组进行扩增与测序，直接比较来自不同生物条件的细胞转录组信息，对细胞分群、发现新的细胞类型、识别疾病进展中起重要作用的罕见细胞、理解细胞异质性、生物多样性等具有重要意义。目前scRNA-seq已被应用于眼科领域，其在视网膜、脉络膜生理学、视网膜疾病如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)中的研究日新月异，为探究ARMD病因，发展规律和靶向治疗提供新的视角。

1 scRNA-seq技术简介

scRNA-seq是在单细胞水平对转录组进行测序的一项新技术，其技术路线包括单细胞捕获、mRNA反转录、cDNA扩增、测序文库构建、高通量测序和数据分析[1]。目前提取单细胞的方法有：荧光激活细胞分选、激光捕获显微切割、手动细胞分选、微流体和微孔等[2]。一个单细胞中的总RNA量大约只有10pg，而其中的mRNA含量只有0.2pg，为获得足够的转录信息，需要进行扩增，目前常用的扩增方法包括PCR扩增法、IVT扩增法、等温扩增法等，其中PCR扩增法中的Smart-seq(switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)/Smart-seq2具有里程碑意义[3-4]，其利用mRNA识别序列、MMLV逆转录酶等方法既能将mRNA高效扩增到需要的数量级，又可尽量避免PCR偏差而得到均一覆盖的文库。IVT扩增如CEL-seq(cell expression by linear amplifcation and sequencing)/CEL-seq2[5]采用线性扩增的测序方法使扩增错误率降低。利用Phi29聚合酶进行扩增的PMA法[6]属于等温扩增法，但扩增随机性大，时常会导致整个基因组不同区域的扩增倍数相差巨大。目前常用的单细胞测序平台是基于微流控体系的10X Genomis公司的液滴法[7]及BD公司的微孔法[8]，它们把单细胞提取、附加DNA标签、mRNA捕获、mRNA反转录与扩增、cDNA建库和高通量测序后的数据分析整合在一起，大大提升了单细胞测序通量和成本，还能得到带有独特分子标签的单细胞基因序列信息。液滴法通过微流控技术将带有barcode、UMI分子标签、引物及酶的凝胶微珠与单细胞混合形成颗粒，做出一个基于油包水乳浊液酶反应原理的分子生物学分析系统。微孔法是将细胞悬液与标记磁珠加入含有约200000个孔的蜂窝板，每个孔中容纳一个细胞，不仅可一次性捕获大量细胞，还能同时实现转录组和蛋白组测序。获得的海量数据需要进一步处理分析，进行数据质控、基因组对比、数据归一化(包括消除基因特异性偏差和调整细胞间计数分布差异等)，然后使用细胞聚类分析、主成分分析和t-分布随机邻域嵌入算法等进行线性与非线性降维，实现对高维数据的降维和可视化[9-10]，最终获得大量单细胞基因序列信息。

2 scRNA-seq在神经视网膜研究中的应用

2.1scRNA-seq在神经视网膜细胞类型鉴定中的应用scRNA-seq在眼科中的应用主要集中在视网膜细胞亚型、相关基因表达和通路的研究上。视网膜是高度异质性的组织，通过形态学、生理学和分子学标准将神经视网膜分为神经节细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞、光感受器细胞5种类型，scRNA-seq还可将其再细分为100多种细胞亚型[11]。例如，Rheaume等[12]确定了40个不同的鼠视网膜神经节细胞簇，并在每种细胞类型中鉴定了富集的基因，且在视网膜神经节细胞亚型中确定了区分左右眼的特异性标记基因，Shekhar等[13]将鼠双极细胞分为15个细胞簇，Macosko等[14]在小鼠视网膜中鉴定了21个不同的无长突细胞簇。细胞亚型的进一步细化分类，能将细胞的基因表达特征与其功能和形态学特征联系起来。

2.2scRNA-seq在黄斑中心凹与外周神经视网膜差异基因分析中的应用黄斑中心凹处的神经元信息传递呈单线连接，故此区视觉非常敏锐，当黄斑区病变时，视力明显下降，为比较黄斑中心凹与外周神经视网膜细胞的区别，有研究从死亡后6h内处理的三组人类供体眼获得中心凹和外周神经视网膜样本，得到8217个细胞，scRNA-seq发现外周神经视网膜视锥细胞明显少于中心凹，且中心凹视锥细胞富含PCP4、YBX1、PRDX1等，其分别在突触可塑性蛋白形成、细胞增殖和应激反应中发挥作用[15-17]。此外，Banin等[18]报道了黄斑区20个高表达基因(如SLC17A6、SNCG、NEFL、NET1、STMN2、YWHAH、UCHL1、DPYSL2、APP、NDRG4、TUBA1B、MDH1、EEF2)和23个在视网膜周边区域高表达的基因(如SAG、RCVRN、UNC119、GPX3、PDE6G、ROM1、ABCA4、DDC、PDE6B、GNB1、NRL)。中心凹Müller细胞也表现出不同于外周神经视网膜的基因表达谱，中央凹Müller细胞富含FABP5(参与神经元分化和神经元损伤的恢复[19])、HES5(与胶质形成有关)，外周Müller细胞富含转铁蛋白和金属硫蛋白基因家族成员MT1G和MT3。且总体而言，Müller细胞的许多基因在不同的单细胞数据集上表现出一致的中心凹或外周神经视网膜富集。这些研究提供了黄斑中心凹具有敏锐视觉的理论支持。

3 scRNA-seq在视网膜色素上皮层和脉络膜研究中的应用

3.1scRNA-seq在视网膜色素上皮层和脉络膜生理学研究中的应用视网膜色素上皮层(retinal pignebt epithelium,RPE)与脉络膜联系紧密，RPE-玻璃膜-脉络膜毛细血管复合体对维持光感受器微环境有重要作用，RPE为感觉层视网膜的外层细胞提供营养，吞噬和消化光感受器细胞外节膜盘维持新陈代谢。脉络膜是一种多样化的结缔组织，包括施万细胞、黑素细胞、成纤维细胞和几类常驻白细胞，scRNA-seq鉴定了两组在转录上不同的施万细胞簇[20]，它们均表达典型的施万细胞标志物PLP1，其中簇1高表达髓鞘蛋白(MPZ)和髓鞘碱性蛋白(MBP)，簇2高表达非髓鞘施万细胞基因SCN7A和NCAM1[21]，有髓轴突的传导速度更快，但缺少髓鞘的轴突是受损轴突的快速反应者[22]。脉络膜血管丰富，在解剖学上分为三层，深大口径血管(Haller层)，中等口径血管(Sattler层)，以及致密的浅表毛细血管网，此血管系统向外层视网膜供应约85%的血液。scRNA-seq检测了上诉三层的特异表达基因，动脉表达SEMA3G、HEY1，静脉表达DARC，脉络膜毛细血管表达CA4、PLVAP[20]。ARMD的发病特征为光感受器细胞的进行性损伤，因此，研究RPE-玻璃膜-脉络膜毛细血管复合体生理学为进一步理解ARMD发病机制有较大意义。

3.2scRNA-seq在黄斑区和外周视网膜色素上皮层或脉络膜差异基因表达研究中的应用ARMD的解剖学异常集中在黄斑区RPE和脉络膜，而某些遗传性视网膜疾病如视网膜色素变性病变位于外周视网膜，这种损伤模式被认为是由于黄斑区和外周RPE或脉络膜之间的分子差异导致，激发了学者对这两个区域分子差异的研究。Mullins等[23]利用RNA测序和qPCR研究发现黄斑和外周RPE或脉络膜之间存在差异表达的基因，例如，BEST1在外周RPE细胞中高表达，ICAM1在黄斑区脉络膜中高表达，此结果在scRNA-seq中得到印证。以往的转录组测序技术比较黄斑区和外周RPE或脉络膜基因后发现许多RPE特异性基因，如LRAT、RPE65，总体表现为在外周视网膜中的高度富集[24]，然而scRNA-seq中，这些RPE特异性基因在黄斑和外周的表达量非常相似。这种差异归因于黄斑区与外周脉络膜细胞密度的不同，脉络膜在黄斑以下最厚，径向变薄[25]，RPE特异性基因表达量被黄斑区中更多的脉络膜细胞稀释，使这类基因在外周视网膜表达显得更高，scRNA-seq消除这一误差，体现了其区别于传统测序技术只反映细胞群平均差异的优势。scRNA-seq为深刻理解视网膜和脉络膜生理学提供了巨大帮助，突出各种细胞类型之间的特征，提高对视网膜生理和疾病区域特异性的理解，为如何应对视网膜损伤提供新的方向。

4 scRNA-seq在ARMD研究中的应用

ARMD能导致患者中心视力的不可逆损伤，是严重的致盲性眼病，临床上将其分为以视网膜玻璃膜疣为特征的干性ARMD和以新生血管生长为特征的湿性ARMD，其与炎症反应、免疫反应、氧化应激等的相关性成为近年的研究热点。

4.1scRNA-seq在ARMD与炎症反应相关性研究中的应用Newman等[26]从基因组水平发现ARMD与炎症反应的相关性，其与许多趋化因子的高表达有关。年龄是ARMD最重要的危险因素，Voigt等[20]通过scRNA-seq确定了婴儿和成人脉络膜内皮细胞转录组的差异，婴儿内皮细胞富含的KLF2、NR4A1、NR2F2能下调炎性表面黏附分子的表达，成人内皮细胞则表现出更多促炎基因的表达，包括黏附分子VCAM1、ICAM1、SELE、SELP以及趋化因子受体ACKR3等[27]。随着年龄的增长，脉络膜内皮细胞炎症介质的产生有诱发ARMD的可能。

4.2scRNA-seq在ARMD与免疫系统相关性研究中的应用Newman等[26]提出细胞介导的免疫反应是ARMD的核心特征，推断ARMD可能是一类具有共同免疫反应过程的疾病。ARMD的蛋白质组学研究表明，脉络膜毛细血管内皮细胞高度表达HLA-A抗原、CA4和PLVAP[28]等免疫因子。肥大细胞脱颗粒[29]和巨噬细胞向脉络膜募集增加[30]与ARMD的发病有关。补体系统是一个复杂的固有免疫监视系统，补体基因的多态性与ARMD易感性密切相关[31]，补体因子H(complement factor H,CFH)是补体替代途径的负调节因子，CFH可增强RPE抗氧化应激的能力，该基因的单核苷酸多态性能显著增加ARMD的患病风险[32]。多种补体基因如补体因子B(CFB)、补体因子I(CFI)、C3、C5等的单核苷酸多态性也发现与ARMD的发病存在显著相关性[33]。scRNA-seq发现CFH主要在脉络膜中表达[20]，表达量为：脉络膜内皮细胞(动脉>毛细血管>静脉)>脉络膜基质细胞(成纤维细胞和周细胞)，且脉络膜比视网膜表达更多的补体抑制剂及大量重要的补体调节因子CD46、CD55、CD59、CD93，提示ARMD的补体系统异常主要发生在脉络膜[20]。补体旁路途径的异常激活使膜攻击复合物(membrane attack complex,MAC)在脉络膜毛细血管上大量沉积[34]，是导致脉络膜毛细血管内皮细胞死亡和功能障碍进而诱发ARMD的重要原因[35]。Mullins等[36]发现老年人尤其是ARMD供体眼的MAC表达量高于青年供体眼，且青年供眼脉络膜不受MAC的影响。RGCC基因为重要的补体应答基因，MAC一旦被激活，RGCC就会增加炎症基因的表达[37]并驱动血管功能障碍，scRNA-seq发现ARMD脉络膜毛细血管中含有丰富的RGCC[20]，认为其可能作为ARMD治疗的靶标基因。细胞介导的免疫反应、补体基因的异常表达、补体旁路的异常激活与ARMD的易感性密切相关，scRNA-seq加强了对ARMD发病机制与免疫反应相关性的深入理解，对靶向免疫治疗ARMD有重要意义。

4.3scRNA-seq在ARMD与氧化应激反应相关性研究中的应用氧化应激是ARMD的发病机制之一，视网膜内的铁代谢失调被认为是导致自由基产生进而诱发氧化应激的原因，转铁蛋白在ARMD患者中的表达增加[38]，缺乏视网膜铁结合蛋白的小鼠会出现RPE和脉络膜损伤[39]。scRNA-seq发现[20]与外周视网膜相比，中心凹转铁蛋白表达量少，提示中心凹转铁蛋白的相对缺乏可能会增加该区域内氧化损伤的易感性。人类和灵长类动物中心凹含有大量的叶黄素类胡萝卜素，它能保护视网膜免受氧化损伤，scRNA-seq中[20]，类胡萝卜素裂解酶BCO2在外周视锥感光细胞中富集，而在中心凹较少[15]，提示类胡萝卜素在中心凹积累的机制。因此，使用抗氧化应激类药物可能对ARMD的治疗有效。

4.4scRNA-seq在湿性ARMD基因表达研究中的应用湿性ARMD又称渗出性或新生血管性ARMD，较干性ARMD少见，但能迅速导致视力下降、视物变形或中心暗点。基于scRNA-seq对湿性ARMD的研究中，脉络膜毛细血管内皮细胞富集基因Egr1[20]能在细胞应激反应中迅速激活，被视为内皮细胞损伤反应的关键介质，且能上调与血管功能有关基因如PDGF、FGF、TGFB、TNFA、ICAM1等的表达。ATF3基因在湿性ARMD供体的脉络膜毛细血管中富集，并能被包括DNA损伤和氧化应激的多种细胞应激源激活。Menon等[40]从6个ARMD人类供体眼黄斑部和外周视网膜中获得约23339个细胞，发现TIMP3、VEGFA、COL4A3基因在ARMD患者的视网膜中高表达，TIMP3和VEGFA被证实与新生血管有关[41]。Rohlenova等[42]诱导小鼠产生脉络膜新生血管，进行了一项针对小鼠脉络膜新生血管内皮细胞基因表达变化的scRNA-seq研究，发现这些内皮细胞表现出与糖酵解、ATP合成和膜运输有关的几个代谢基因的异常表达，说明此状态下的内皮细胞代谢需求极高。来自这个小鼠脉络膜新生血管细胞模型中的15个最丰富的基因，其中有11个在人类湿性ARMD供体中表现出一定程度的富集。基于scRNA-seq发现与湿性ARMD相关基因的表达，为临床针对靶基因治疗湿性ARMD提供理论依据。

5新兴单细胞测序技术的不断探索

虽然scRNA-seq已成为剖析细胞异质性的重要工具，但细胞异质性体现在基因组、表观基因组、转录组、蛋白组、空间，甚至时间等多个维度上，scRNA-seq仅局限于一维层面的测序是不完整的，因此，许多新兴的单细胞测序技术应运而生。空间转录组学从一个完整的组织样本中获取全部的转录组数据，能够定位和区分功能基因在特定组织区域内的表达情况[43]。目前的scRNA-seq和空间转录组学只提供了基因表达的静态信息，这违背了RNA动力学和转录活动的随机性，基于时间序列的单细胞转录组分析可以揭示细胞生物信息的时间动态[44]。单细胞的异质性本质上是由基因组、转录组、蛋白组、表观基因组共同定义的，单细胞多组学能对同一细胞同时整合多种组学数据，更完善了细胞的遗传信息[45]。然而，这些技术在眼科领域中的应用仍相对局限单薄，随着研究者持续不断的探索，相信单细胞测序技术多元化、多维化、多方面的研究在不久后将惠及眼科研究领域。

6总结与展望

scRNA-seq从单细胞水平分析细胞异质性，是鉴别细胞与细胞间转录组差异的新兴技术。本文总结了scRNA-seq在视网膜、脉络膜发育及ARMD研究中的应用，展示细胞发挥生理学作用与其所表达基因的相互关系，加深了对视网膜细胞生物学和疾病病理生理学的理解。scRNA-seq将转录信息与ARMD发病机制相结合，为深入理解ARMD发病机制及靶向诊治方案提供了全新的思路。随着scRNA-seq测序成本的不断降低，学者实现更多方面的生物学和技术重复，从而提高了不同生物学条件下检测的多样性和一致性，大量的研究将促进新一代视网膜疾病诊治的发展。但scRNA-seq局限于对细胞异质性一维层面的理解仍存在较大缺陷，空间转录组学、时间分辨测序、多组学以多维、丰富的研究赋予细胞异质性更完整多态的理解，随着众多突破性技术的出现，单细胞测序在眼科领域中的应用将会朝着更多元化的方向发展。