早期圆锥角膜的诊断技术研究进展

徐 悦，张晓峰

0引言

圆锥角膜(keratoconus，KC)是一种双侧和不对称的扩张性角膜疾病，以进行性角膜厚度变薄和突出为特征，可能导致严重的视力障碍[1-2]。中晚期KC的眼部症状和体征往往典型，包括角膜基质变薄、锥形隆起、Fleischer环、Vogt条纹等[3]。早期KC常常因症状和临床体征不明显而易被忽视[4]。目前对于KC的分期，包括KC严重度评分和Amsler-Krumeich分类等，都没有为早期KC的检测提供明确的指导[5]。对顿挫型KC和可疑KC的定义还在不断完善中[6-7]。另外，虽然存在许多检测技术，但是临床医生对多种角膜特征参数的认识相对不足，限制了这些技术在早期KC诊断中的运用和价值。本综述旨在回顾KC诊断技术研究进展，以期早期识别KC患者，降低医源性角膜扩张的风险并减轻角膜移植的负担。

1角膜前表面形态参数

角膜前表面曲率和高度值的异常是KC有效的判别参数，患者角膜前表面曲率异常通常早于角膜厚度和视力的异常。基于placido盘的角膜地形图可以通过检测角膜前表面局部陡峭程度，生成量化角膜表面不规则性的多个参数，常被用于诊断KC[8]。通常来说，当出现以下角膜地形图参数异常应当引起重视并进行进一步检查：散光大于5屈光度(diopters，D)，平坦子午线角膜曲率或陡峭子午线角膜曲率大于48D，最大角膜曲率大于49D，角膜非球面系数大于-0.50μm[9]。改良的Rabinowitz-McDonnell检验，以正常角膜为标准，将模拟角膜镜读数(simulated keratoscope reading，SimK)介于47.2～48.7D和(或)角膜下方与上方平均屈光度差值(inferior-superior diopter asymmetry，I-S)介于1.4～1.8D归为疑似KC[10]。

Pentacam眼前节分析系统中描述角膜前表面形态特征的参数包括：表面变异指数、高度不对称指数、垂直不对称指数、高度离心指数、KC指数、最小曲率半径、中央KC指数、不规则指数[11]。这8个参数均具有较高的敏感性，特别是表面变异指数和最小曲率半径[3]。Donoso等[12]提出Pentacam系统中的KC指数、高度离心指数、BAD增强扩张分析(Belin/Ambrosio Enhanced Ectasia Display)的总体偏差，以及OPD-Scan屈光分析仪中的KC预测指数、表面不对称指数和高阶三叶草像差的总和，均可用于区分早期KC和正常眼，而组合两个设备的参数时，显示出了更好的诊断效力。角膜前表面形态参数仍然是目前临床工作中，用于区分早期KC眼和正常眼最常用的参数。

2角膜后表面形态参数

与正常眼相比，早期KC的角膜后表面主要表现为角膜后表面下方曲率的增加和后表面高度的异常[13]。基于海拔的角膜断层成像包括基于裂隙扫描技术的Orbscan眼前节分析诊断系统，以及基于Scheimpflug成像原理的Pentacam、Sirius和Galilei眼前节分析仪。前者由于分辨率低、图像获取时间过长和不能获得角膜后表面的实际测量值，已被Scheimpflug成像原理的眼前节分析系统替代[14-16]。

Pentacam系统提供了可重复测量的角膜后表面参数，主要包括：后表面中央散光度、后表面最小矢状曲率、后表面高度最大值、最小值和高度差[11]。OCULUS Pentacam软件还提出了“Belin ABCD”的KC分级系统[17]。它根据角膜最薄点3mm区域的角膜前、后表面角膜曲率半径，角膜最薄点厚度和最佳矫正视力将KC分为0～4级[9]。其中，1～4期的角膜前表面曲率与传统的Amsler-Krumeich分类呈现相关性，通过融入对角膜后表面的评估和分级，更全面地描述了角膜结构和功能的改变[17]。De Sanctis等[18]发现角膜后表面高度大于29μm可作为检测亚临床KC患者相对特异但不敏感的方法。

Sirius眼前节分析仪研究的角膜后表面主要参数包括后表面曲率对称指数，后表面Baiocchi-Calossi-Versaci指数，角膜后表面膨隆的最高点以及后表面4.5mm或8mm范围内每单位面积均方根值[19]。一项利用Sirius眼前节分析仪回顾性分析1632眼的角膜前表面、角膜后表面和角膜最薄点厚度的研究提示，在区分亚临床KC患者与正常人时，最敏感的是角膜后表面的参数[20]。在多种角膜测量参数的基础上，Sirius利用支持向量机自动将所测量的眼睛归类正常眼、KC眼和亚临床KC眼等，同时提出角膜后表面曲率和测厚数据对于检测亚临床KC眼十分重要[21]。

Galilei眼前节分析仪与Pentacam相似，但具有跟踪眼球运动的功能，减少了运动误差。不规则散光指数大于0.450，角膜屈光力标准偏差大于1.065，以及表面规则指数大于0.735，被认为是利用Galilei眼前节分析仪评估顿挫型KC患者具有诊断意义的指标[8]。Jafarinasab等[22]使用Galilei眼前节分析仪评估了中央3、57mm区域内最大角膜前、后表面高度，发现中央7mm区域的最大角膜后表面高度能最好地区分亚临床KC。

基于Scheimpflug成像原理的眼前节分析仪可同时测量角膜前、后表面的参数和角膜厚度。其中，角膜后表面参数和角膜厚度分布图是临床工作中诊断早期KC的重要参数[23-24]。另外，不同仪器的参数之间存在差异，不能对其进行简单地互换。因此，在诊断早期KC时，需要强调对不同仪器得到的参数进行具体分析[25]。

3角膜曲率数学分析模型

Maeda等[26]通过对SimK1、SimK2、表面不对称指数、差异扇区指数、对侧扇区指数、中央/周围指数、不对称散光指数和分析面积8个地形图参数的计算分析得出KC预测指数，该指数大于0.23的患者被提示为KC患者。其中差异扇区指数和对侧扇区指数对周边角膜异常陡峭的鉴别较为敏感，而中央/周围指数对中央角膜异常陡峭的鉴别较为敏感。KC百分比指数是基于中央角膜屈光力、I-S值、角膜散光指数和最陡峭轴的相对偏移量计算得出的，KC百分比指数在60%～100%被认为是可疑KC[27]。此外，还有研究构建了一个神经网络，并将10种不同的地形图参数作为网络的输入参数，以计算KC严重程度指数，当KC严重程度指数介于15%～30%被认为是可疑KC眼。BAD增强扩张分析通过将角膜海拔和厚度数据相结合，并将其与“增强的最佳拟合球面”相比较，从而更敏感地获取早期KC的改变[28]。Pentacam中的BAD将测得的角膜前、后表面海拔数据与8mm范围固定光学区计算出的最佳拟合球面数据相比较，对角膜前后表面海拔变化、角膜最薄点厚度、角膜最薄点位移和厚度改变与正常人数据库的各参数平均值的标准偏差进行回归分析，从而做到更为灵敏地对早期KC进行筛查[29]。

4角膜像差

KC患者的角膜上下方不对称膨隆、角膜顶点移位，导致彗差明显增加；而角膜中央相较于周边屈光力的明显增加，也可导致角膜球差的显著增加。KC眼的角膜总高阶像差约是正常眼的38倍，其中最显著的差异体现在垂直彗差，大约是正常眼的78倍[30]。因此，以垂直彗差为代表的角膜波前像差被认为可用于区分早期可疑KC眼和正常眼[8]。同时，将角膜前表面波前像差和眼波前像差纳入分析，可将诊断的敏感度和特异度提高到80%以上[30]。Naderan等[31]的研究发现，相较于角膜像差，全眼像差更能区分顿挫型KC和正常眼，提示眼内像差和角膜后表面的改变发生在角膜前表面改变之前[31]。在区分早期KC和正常眼时，以Zernike像差为基础的三阶像差、球差被认为具有最高的判别能力，可以识别非常早期的KC患眼[32-33]。同时需要注意，角膜高阶像差随着瞳孔直径大小的增大而增加，但可疑KC和KC患者的增加幅度比正常眼更大，其中三阶像差对角膜总像差的贡献随瞳孔增大而减小，而四阶像差的贡献随瞳孔增大而增大。因此，在鉴别早期KC时，应以较大的瞳孔直径为宜，可取瞳孔直径为6mm时，观察像差的变化。因此，当发现总高阶像差，尤以彗差或负性球差增高时，应引起重视，并结合角膜曲率、海拔和厚度等角膜地形图数据进一步排查KC。结合角膜像差参数，可将早期KC诊断的敏感度和特异度提高到90%以上[34-36]。

5角膜上皮及角膜全层厚度地形图

在KC中，角膜上皮会通过在顶点处变薄而周围的环形区域内增厚来补偿角膜基质的变薄和膨隆，一定范围内代偿不规则的前表面，称之为“角膜上皮重塑”[37-38]。因此，仅检测角膜前表面难以发现这一微小改变，加入对上皮和全层厚度的检查，有助于早期KC的诊断。目前，角膜上皮和全层厚度的检测方法主要包括：接触式测量(超高频率数字超声仪)与非接触式测量光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)[10]。Feng等[39]利用超高频率数字超声仪发现角膜全层厚度的测量对区分地形图异常的可疑KC眼具有重要意义。Silverman等[40]根据超高频率数字超声仪衍生的上皮和基质厚度图开发了一种基于6个角膜上皮和基质厚度相关变量的模型，并报道该模型与KC严重程度等级相关。

角膜厚度相对应区域的不对称性是诊断早期KC的关键。OCT不仅构建了角膜全层和上皮厚度地形图，显示了角膜顶点和最薄点的位置，还自动比较了I-S角膜及上皮厚度差值，以及鼻上-颞下角膜厚度差值，这些对早期KC均具有提示作用[41]。Rattan等[42]发现，可疑KC眼角膜下方上皮厚度更薄，上皮最薄点厚度的偏移是早期KC诊断的有利指征。更为重要的是，OCT可以检测到早期KC患者中“角膜上皮重塑”等早期征象[43-44]。Li等[45]发现角膜各亚层厚度分布与角膜生物力学相关参数之间存在显著的相关关系。因此，OCT可用于获取角膜全层厚度以及角膜上皮厚度、角膜最薄点厚度、角膜最薄点相对瞳孔中心的坐标，这些OCT参数对早期KC的诊断具有重要提示作用。

6角膜共聚焦显微镜

角膜共聚焦显微镜(invivoconfocal microscopy，IVCM)是一种在细胞水平上非侵入式活体成像的技术[46]。在临床上没有明显Vogt条纹的患者中，50%患者在IVCM的角膜基质图像中观察到了条带[47]。IVCM的使用有助于观察KC患者Bowman层的破裂和中央上皮下神经丛的变化，同时，还可能观察到上皮细胞拉长、基质皱褶、上皮基底膜下神经增厚以及内皮细胞的多形性增加[48]。体外研究提示KC患者的角膜上皮基底膜细胞密度降低，IVCM证实并进一步发现这一差异与KC的严重程度无关[49-50]。Bitirgen等[47]研究发现，在KC的早期阶段，角膜上皮基底细胞的退行性改变先于角膜上皮基底细胞的丢失。许多研究表明KC患者角膜神经纤维出现异常的分支模式、密度降低、弯曲度增加和增粗，角膜基底下神经失去正常的放射状和中央螺纹状的形态，取而代之的是，锥顶处基底下神经形成一个包含许多闭合环形的曲折的网络，而圆锥基底部神经围绕底部呈同心圆式地延展[47]。在轻度KC患者中，角膜上皮基底细胞的密度明显降低，而角膜浅层及深层基质细胞密度和内皮细胞密度没有显著差异，提示KC变性过程开始于上皮基底细胞水平，为利用IVCM进行早期KC的诊断提供了依据。Ozgurhan等[51]则提出早期KC患者的浅层和深层角膜基质细胞密度较正常眼降低，而平均基质神经直径较正常眼增高。

7角膜生物力学

角膜基质纤维的丢失、单个胶原纤维的方向改变、交联数减少以及角膜细胞功能障碍，都会导致角膜机械稳定性的下降，KC发生发展过程中均伴有角膜生物力学的改变，而角膜曲率、高度和厚度的变化均是角膜扩张的继发表现[52]。因此，对角膜生物力学特性的研究可能有助于早期KC的诊断。眼反应分析仪可以测定包括角膜迟滞和角膜阻力因子等多种角膜生物力学参数，两者在KC眼中均降低，但受中央角膜厚度和眼压的影响很大，难以区分早期KC眼和正常眼[53]。Corvis ST角膜生物力学分析仪可动态记录、分析角膜受压形变和复原过程中发生的生物力学改变，并记录角膜厚度、眼内压及角膜变形幅度、压平长度、反向曲率半径、压平速率等生物力学数据。在控制了眼压和角膜厚度后，变形幅度是临床前期KC诊断中比角膜迟滞更为敏感的参数，但在用于区分早期KC眼和正常眼时仍存在较大的重叠区[54]。Brillouin显微镜是一种新型光学弹性成像技术，目前被用于体外检测角膜，该技术的体内版本正在开发中，被认为可能是评估KC生物力学特性更灵敏的工具[55]。KC患者的平均Brillouin频率降低，在锥体区域最为明显，且随着疾病的严重程度增加而增加，轻度KC眼可通过Brillouin频率来区分双眼严重程度。因此，双侧生物力学的不对称性可作为早期KC的诊断指标。

8基因检测

目前，包括VSX1、DOCK9、TGFβ1、SOD1、miR-184、COL4A3、COL4A4在内的多个基因，因在KC患者中被检测到相应突变或是与KC发病机制相关而被选为KC的候选基因[29]。其中，VSX1和SOD1这2个基因被关注得最多[56]。Li等[57]第一个报道了关于KC的全基因组关联研究(genome-wide association studies，GWAS)，提示2q21.3染色体上RAB3GAP1基因附近的一个基因组区域与KC存在潜在的关联，且被Bae等[58]的另一项独立的研究验证。Burdon等[59]之后进行了第二次关于KC的GWAS研究，报道的最显著的关联位于HGF基因的上游，其特异性变异也与正常人的血清HGF水平有关，且该关联被Sahebjada等[60]的独立的研究复制。一项GWAS研究提示2个中央角膜厚度相关的基因组区域FOXO1和FNDC3B与KC风险相关[61]。最新的关于KC转录组学的研究除了鉴定了编码基因的组织特异性作用外，还开始评估新型非编码RNA靶标，KC患者角膜中许多基因发生了严重的改变，特别是那些影响角膜组织生物力学特性的基因[62]。从KC患者中收集的角膜上皮微小RNA微阵列中鉴定出许多上调和下调的微小RNA，提示在微小RNA对应的靶基因中细胞连接、细胞分裂和运动活性过表达[63]。通过对KC相关基因组区域进行高通量生物信息学分析，发现微小RNA基因和单核苷酸突变在包含KC基因座的区域中非随机分布，以微小RNA为基础的研究虽尚不成熟，但或将成为未来基因研究的重点，从而为早期KC诊断的生物标记物和潜在治疗靶标提供新的思路。

9小结

综上所述，基于placido盘角膜地形图获得的角膜前表面形态特征仅依赖于角膜前表面曲率图，单独用于诊断早期KC患者的灵敏度较低。基于Scheimpflug成像原理的眼前节分析系统增加了对角膜厚度和角膜后表面形态特征的分析，是当前诊断早期KC最主要的手段。OCT检测角膜上皮层及全层厚度地形图，可获得角膜最薄点厚度及坐标，其偏离角膜中心情况的分析对早期KC的诊断具有重要的提示作用。综合角膜前、后表面形态特征、角膜以及角膜最薄点厚度及其偏离角膜中心等检测结果是目前诊断早期KC相对最有效和可靠的方法。角膜曲率数学分析模型则进一步优化了KC相关参数的选择和计算模型，有助于简化评估流程。角膜波前像差、IVCM和角膜生物力学的改变对早期KC的诊断均具有一定的提示作用，但这些检查相应指标的敏感度和特异度有待进一步提高。以上对于早期KC诊断的技术手段，多仅关注患者单眼的情况。今后通过人工智能对患者的双眼数据进行对比和判断或将成为早期KC诊断研究的热点。基因检测为早期KC的诊断提供了新的方向，但由于KC发病基因目前尚不明确，并且不同人种之间遗传特性差异也很大，因此早期KC基因诊断技术尚不成熟。