微生物混合感染性角膜炎动物模型研究进展

李玉婷，李 妍，王 岚，胡竹林

references for the further development and research of animal models of the disease.

0引言

微生物角膜炎(microbial keratitis,MK)是细菌、真菌、病毒、寄生虫或多种感染因子混合感染人或哺乳类动物眼部引起创伤或感染的角膜疾病[1]。MK是单侧角膜失明的重要原因之一[2]，在热带地区，真菌性角膜炎(fungal keratitis,FK) 约占所有MK的40%[3]，我国FK的致病菌主要为两种，分别是镰刀菌属(25.5%)和曲霉菌属(10.3%)[4]；而在温带地区，细菌性角膜炎(bacterial keratitis,BK)更为常见[5]，致病菌中比例最大的是表皮葡萄球菌占34.5%，其次是肺炎链球菌占13%，最后是金黄色葡萄球菌占10.2%等[6]。由两种以上微生物引起的角膜混合感染相对少见，其可能是合并感染，也可能是继发于现有微生物的二次感染。最近一份关于角膜感染的报告指出，存在混合感染的现象，细菌和真菌混合感染的比例占1.9%，而细菌和棘阿米巴原虫的混合感染要更多一些，占比为15.8%[7]。另外，一些病例报告里面，对于不同种的细菌和真菌，分别进行了混合感染的相关介绍，例如表皮葡萄球菌和镰刀菌属[8]、真菌和革兰阳性球菌[9]、假单胞菌和烟曲霉菌[10]等。混合感染性角膜炎引起的角膜炎症会损害角膜上皮和角膜深层，严重时会引起角膜穿孔[11]，进一步导致视力下降，甚至视力丧失，有的患者需要摘除眼球或剜除眼内容物，才能防止病变进一步扩散至全身，因此，及时有效地治疗对控制病变的发展十分重要。由于混合感染性角膜炎的病理机制尚不明确，建立动物模型对于探索其发病机制具有重要意义。与此同时，动物模型的建立也有助于该病的预防、诊断和治疗等。本文对近年来国内外微生物混合感染性角膜炎动物疾病模型制备方法进行总结。

1实验动物的选择

在医学研究方面，建立动物模型是非常有必要的，可以帮助人类对疾病进行预测、预防，进而提前进行干预、治疗，控制疾病的发生发展。因此在研究许多重大疾病的时候，需要建立相应的动物模型，但缺乏合适的动物模型一直是全球各个国家关注并需要攻克的难题，人们也在不断建立和完善各类疾病动物模型[12]。建立模型的时候，对于动物的挑选，需要根据菌种的相关特征及实验需求，找到最为合适的实验动物。

目前研究中使用的动物主要有兔、鼠、猴[13]。与人类的角膜相比，兔角膜要更大一些，易于手术操作，在手术过程中及术后，也可以更细致的观察到角膜局部的变化，而且兔的结膜是红色的，其前房出现的纤维蛋白更容易被发现、观察；同时，可以获得较多的实验标本，还可以获得更多具有实用性的疾病参数，兔子中有两个国家的品种使用较为广泛，一个是新西兰的白兔，一个是荷兰的带纹兔[14-15]。但从免疫学观点看，实验用兔并不是完全没有缺点的，存在一定的局限性，它的繁殖发生在较为亲近的群体当中，存在组织相容性，由于不是近交系动物，很难确定其免疫遗传背景[16]，这些都会给实验造成不确定性和稳定性差。小鼠的角膜与人类相比较小，无论是在手术操作方面，还是在取材方面，都没有兔眼简便，而且不利于微生物混合感染大体形态学的观察。虽然小鼠缺陷很明显，但也不能忽视它的优势。因为小鼠不仅具有较多的近交系品系，还具有较多的远交系品系，特别是近年来广为人知的转基因研究，转基因后获得的小鼠，可以对一些特殊因子进行针对性分析，同时提供生物制剂，除了BALB/c小鼠外，还有C57BL/6品系小鼠，它们都是实验中经常用到的品系类型。两类小鼠进行比较后发现，第一类小鼠更加敏感一些，针对细菌感染的程度更高[17]，实验上更为常用。猴属于灵长类动物，猴眼的各层组织结构特别是角膜，与人眼极其相似，实验人员发现，用猴子造模能更好地模拟疾病的发生发展及转归[18]。但是因为猴子价格昂贵，在实际工作中操作不便，不能进行大规模、大批量的实验，也不能获得较多的实验标本，故猴子造模应用较少。近年来，树鼩(tree shrew)模型越来越得到人们的关注。树鼩不仅体型小、生殖周期短、寿命短，饲养成本也低，是现代生物医学研究中最有望替代灵长类动物的一类实验动物[19]。树鼩角膜大小适中，角膜各层结构和人类角膜较相似[20]，而且与啮齿类相比，与人类亲缘关系更近[21]，作为造模动物来说，是角膜疾病较为理想的造模动物。但树鼩研究历史较短，无特异性抗体，缺乏特异性强的诊断试剂，因此其实验结果的特异性、可靠性不高，还有待进一步研究。其他还有用豚鼠、猫等动物作为模型。

因为实验动物大多数为近亲交配，这与远系繁殖的人类就有较大差异。另外根据实验动物的不同，在解剖上也存在不同的特征，其他还包括组织成分、功能组件的差别，如人的角膜直径大约为11～12mm，而兔的角膜直径为13mm，鼠的角膜直径2.2～3.5mm，树鼩则为8～9mm[22-23]，四者进行对比，人类的角膜厚度最厚，眨眼间隔时间较短，只有2.8s，但兔子和小鼠的眨眼间隔时间，是人类的10倍不止，达到30s；另外，只有兔子眼表有一层瞬膜，而人类没有，这会造成眼表观察时的各种差异[24]。所以，不管动物在某些方面的特征与人类有多么相近，依然不能完全替代人类，实验造模的时候还是存在差异。选择好适合的动物类型后，需要先适应性饲养7d左右，使用放大镜或手电筒检查动物双眼是否存在眼疾，进行相关实验操作的时候，需要给予实验动物一定的关爱，且不违背动物伦理[25]。

2菌株的选择

建立混合感染性角膜炎动物模型要根据流行病学调查结果或实验要求，选择临床常见混合感染菌种，以便动物模型能广泛应用于临床，促进临床混合感染性角膜炎的防治进展。

细菌和真菌是角膜混合感染最常见的类型。被报道较多的有葡萄球菌属、曲霉菌属及镰刀菌属[3, 26-28]。许多疾病中都描述了细菌与真菌之间的相互作用，包括真菌和革兰氏阳性菌，如戈登链球菌和白色念珠菌[29]、金黄色葡萄球菌与新型隐球菌[30]以及金黄色葡萄球菌和烟曲霉[31]。其中，Granillo等[31]在研究中发现，金黄色葡萄球菌在混合生物膜中抑制了烟曲霉的生长。最近一份关于感染性角膜炎的报告指出，在所有3183例病例中，有2.39%的病例为细菌和真菌混合感染[32]。Ahn等[8]进行了一项历时8a(2000/2007年)的关于细菌和真菌性混合感染角膜炎的回顾性研究，报告称混合感染最常见的微生物组合是镰刀菌(fusarium)和表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)占39%。革兰氏阳性菌在细菌中最常见(占细菌培养总数的79%)，其中表皮葡萄球菌占比最大，达到了45%，其次是草绿色链球菌(streptococcus viridans)占11%。真菌中，丝状真菌(filamentous fungi)占主导地位(占所有真菌培养物的 79%)，其中最常见的是镰刀菌属占56%，其次是念珠菌种(candida)占12%。结合以往的病例报道发现，临床上细菌真菌混合感染较为常见，但是在建立FK动物模型时，因为实验动物普遍对真菌不易感，常常需要对实验动物进行免疫抑制，而免疫抑制会加重细菌的感染，因此免疫抑制可能会对建立细菌真菌混合感染动物模型产生一定影响。

实验结果除了具有真实可靠性以外，还需要具备可重复性，进行动物模型制作时，尽可能选用权威微生物种保存机构(如American Tissue Culture Collection，ATCC；中国科学院微生物研究所等)保存的标准菌株，最好选用临床混合感染性角膜炎患者的分离标本。

3操作方法

3.1菌液配制在实验开始前24h或48h，将菌种接种于营养琼脂斜面进行活化，细菌菌株如化脓性链球菌，接种于血琼脂培养基[33]，如果是大肠埃希菌，接种于中国蓝培养基[34]，37℃下恒温培养1～2d；真菌菌株一般接种于沙保氏培养基(sabouraud dextrosee agar，SDA)或马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato extrose agar，PDA)30℃温度或室温条件下培养72h；挑取生长良好的菌落振荡培养，配制微生物混悬液。细菌浓度大多数情况下为1×108～1×1010CFU/mL[35]；关于真菌菌液浓度，国内外报道的结果不一，浓度从106～1010CFU/mL不等[36-38]。Wu等[39]利用鼠制作真菌感染模型的过程中发现，角膜上皮损伤后，真菌接种至少需要102CFU/mL才能引起角膜感染；随着菌液浓度的增加，角膜的感染成功率提高，而一次接种达到106CFU/mL就足以使所有角膜感染真菌。

菌液配制并不是统一的标准，需要根据微生物的具体功能进行调节，例如对肺炎链球菌进行培养时，选择羊血琼脂培养基，还要加入5% CO2[40]。不同菌种间毒力、致病性有所区别，且存在相互拮抗抑制的可能，混合感染时不同菌液的浓度选择对实验的成功至关重要。

3.2微生物接种方法

3.2.1角膜表面划痕法二十世纪七十年代初期，Gerke等[41]首次提出用角膜表面划痕法通过小鼠制作绿脓杆菌模型，此方法一经推出，就获得了众多学者的支持和尝试。该方法在不划破基质侵入前房的前提下，使用无菌25～30G注射针头在角膜表面划出长度为1mm左右的3～5道平行的伤口，选择吸液管将菌液(一般为5μL)接种于小鼠的角膜表面[42-43]。此方法优点：易于操作，感染需要的时间较短，同时对于病原微生物和角膜伤口而言，可以促进它们之间的相互作用；缺点：感染率偏低。另外菌液流动性较好，较早滴加的菌液可快速弥散于受损角膜，可能对后滴加的菌种造成影响，降低后者的侵袭性。因此，此方法需进行改进，例如进一步明确所接种病原微生物的种类以及固定或麻醉实验动物的时间，以增加病原微生物的感染率。

3.2.2基质内注射法到了二十世纪七十年代中后期，Kupferman等[44]提出了角膜基质内注射模型。用微量注射器定量抽取适量(一般为5μL)的菌液，选择角膜近中心处进针，针尖进入至角膜实质层下1/3，形成白色菌斑，直径范围在5～6mm。优点：该方法操作方便，具有良好的重复性。对于感染具有难度的菌株，例如真菌感染，也能起到相应的效果，具有较高的感染率；缺点：此方法的感染过程在一定程度上破坏了实验动物角膜的正常结构，与人角膜自然感染过程存在较大差异，所以此法更多是用来判断角膜炎药物疗效和探究诊断方法。

3.2.3角膜接触镜法随着配戴隐形眼镜的人数不断增多，角膜接触镜引发的角膜感染也越来越常见，学者们结合角膜表面划痕法，提出了角膜接触镜法。即对于实验动物的角膜直径进行标记，使用角膜环钻，将上皮去除，戴上角膜接触镜，并滴入适量菌液，或在培养基上将角膜接触镜与适当浓度(多为108CFU/mL)菌液一同培养24h，温度保持在30℃，然后戴在损伤角膜表面。缝闭眼睑，完成接种后的48h，再拆除缝线，用裂隙灯进行观察。有关研究表明，低氧性损伤是发生感染的前提，隐形眼镜相关角膜感染最有可能是由于低氧透接触镜导致的[45]。所以，在建立模型的时候，如果想将角膜感染率提高，可以通过建立缺氧模型来实现。此方法的优势为：将病原微生物感染角膜的过程尽可能地进行了模拟和还原，不仅提高了感染率，还能对发病过程及机制进行研究；缺陷则是操作具有一定的难度，需要更多的时间，对于实验动物的麻醉时间及实验操作人员，有比较严格的要求。

3.2.4“微口袋”法为了建立混合感染模型，Ponce-Angulo等[46]采用了一种称为“微口袋”的新技术，他们使用的方法是在接种金黄色葡萄球菌及镰刀菌前，预先用环磷酰胺和甲基强的松龙联合处理实验用小鼠(分别于接种前5、3、1d肌内注射80mg/kg甲基强的松龙及150mg/kg环磷酰胺)，制造出免疫低下的动物模型。每个微口袋的长度为2mm，用针头在角巩膜缘制造一个病变，操作时要小心谨慎，以免角膜穿孔和改变眼睛的内部结构，将细菌和真菌细胞以相同浓度1×105CFU/mL同时接种到角膜组织中，闭合动物睑裂几秒钟，保证角膜里面菌液的分布是均匀的。针刺的程度不一，会造成不同程度的创伤，伤及角膜基质可能会影响混合感染的自然病程，不同个体间的感染病变也可能因为创伤程度不同而变化，使动物模型的稳定性不佳，此法还有待进一步的研究。

4感染成功后的鉴定方法

造模后需要对实验动物进行诊断及鉴定诊断，看角膜是否有微生物感染，是单一菌种感染还是混合感染；同时还需要鉴定感染病原菌，确定是哪种病原微生物导致的感染。

4.1病原学培养检测对于感染性角膜炎来说，微生物学是主要诊断方法，临床上常用的基本诊断工具依次有：涂片、培养和敏感性测定，是检测角膜感染的“金标准”[47]。主要目的是对真菌、细菌及阿米巴原虫进行分离、培养及鉴定。不同菌种检测操作方法如下：(1)马铃薯葡萄糖斜面培养基的真菌培养：标本接种后，待菌落生长，利用胶带法和小培养法，对真菌种属进行鉴定。(2)血平板、巧克力平板的细菌培养：标本接种于两种平板后，放在营养肉汤中，等待细菌增长，任意两种培养基培养阳性后，分离出单个菌落，然后鉴定出细菌的种类。(3)阿米巴培养：标本接种后，添加50μL大肠杆菌菌液共同培养，利用斜面镜观察，找到阿米巴滋养体或者包囊为阳性。

平板培养的优点:可选择混合感染的菌种适宜的平板,刮取角膜组织进行平板培养后，可在平板上观察到不同的微生物生长，是较为直观的鉴别方法，同时可进一步分离纯化菌种进行鉴定。但由于混合感染的病原菌生长周期各不相同，如细菌真菌混合感染，细菌生长相对较快，真菌生长相对缓慢，培养时长增加等因素，会影响平板培养的阳性检出率。

4.2角膜涂片染色细胞学检查首先，取材部位为动物模型角膜病灶处，及时涂片，使用甲醇原液进行固定，时间一般为60～120s，然后用稀释吉姆萨染液染色后直接镜检，经济快捷、可反复操作、准确率高，并可镜下直接检测有无真菌或细菌感染，协助早期确定诊断，目前是我国快速诊断感染性角膜炎的主要检测技术[48]。除了以上染色方法，还可以选择荧光染液对真菌进行荧光染色检测，在荧光显微镜下可以观察到真菌的长丝状蓝色或者蓝紫色高亮荧光[49]。

该法方便快捷，可以迅速对感染性角膜炎做出诊断；但当取材部位不准确或有所遗漏时，涂片也会呈假阴性结果。因此，需要掌握正确的取材方法，注意刮取不同的角膜病灶处，进行染色、镜检、观察。

4.3角膜激光共焦显微镜检查麻醉或处死动物后，将激光扫描摄像头的位置调节好，使激光光束位于角膜病变区域。利用非连续手动扫描模式，对病灶区进行扫描。优点是可以对感染性角膜炎的病原体影像如真菌菌丝，阿米巴包囊、空囊、滋养体，快速进行诊断[50]。但是共焦显微镜属于形态学检测[51]，大部分感染性角膜炎在共聚焦显微镜下的主要特征是出现炎症细胞，因此若是细菌混合感染，或真菌、阿米巴感染症状不典型，则无法区分。

4.416SrRNA基因序列分析法提取病原菌的DNA，采用通过引物经PCR扩增16S rRNA基因片段，然后对扩增片段进行测序。此方法特异性高，可以用于感染性角膜炎检测尤其是不清楚感染病原菌及排除其他病原菌同时感染的情况[52]。

但是混合感染若不进行纯化，扩增时不同菌种的引物不同，可能会导致扩增失败或导致鉴定错误。同一菌种采用通用引物进行扩增，结果出现双峰，对鉴定结果也会产生影响。为了避免鉴定失败，可先将菌种平板培养后分离纯化，再进行测序，或进行高通量测序。

5小结

综上所述，微生物混合感染性角膜炎逐渐增多，严重威胁着人类的眼部健康，必须给予重视。为了更好地研究人类微生物混合感染性角膜炎的发病机制，就需要掌握一系列感染成功率高、疾病发生发展过程与人角膜混合感染的过程相似、一致性强的动物模型制作的方法。但目前存在较多的问题和困难，需要进一步的尝试和克服，以保证动物实验研究的成果客观、可信、可重复，能够为探索该病的发病机制和指导临床提供重要的基础，降低其致盲率，为感染性眼科疾病做出巨大贡献，并让研究能够更进一步。