气相色谱法测定茶鲜叶中4种有机磷农药残留量的不确定度分析

刘腾飞，张 丽，杨代凤, ，朱 松，周锋杰

（1.江苏太湖地区农业科学研究所，江苏苏州 215105；2.苏州市职业大学食品安全与营养研究中心，江苏苏州 215104；3.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122；4. 苏州市农产品质量安全监测中心，江苏苏州 215128）

茶叶是我国重要的经济作物之一，也是我国传统的特色农产品，具有悠久的历史和文化底蕴[1-2]。茶叶质量安全是保障茶产业高质量发展的重要基础，而茶鲜叶作为茶叶加工的原材料，其安全性决定了茶叶的质量安全。在茶叶生产中，病虫害的发生严重影响茶叶的产量和品质[3-4]。为保障茶叶优质高产，农药的使用不可避免。其中，有机磷农药具有价廉、高效、残留期短等优点，是我国茶叶种植过程中使用的主要农药种类之一[5]，但由于长期使用或使用不当，造成其在茶叶及茶鲜叶中的残留问题时有发生[6-11]，由于此类农药高毒，可引起神经系统中毒[12]，从而给消费者健康带来安全隐患，因此采取灵敏、可靠的检测技术对有机磷农药残留进行分析十分重要。

目前，在检测茶叶中有机磷农药残留时，国家已制定了相应的检验标准，例如GB/T 23204-2008[13]、GB 23200.13-2016[14]和GB 23200.121-2021[15]等，但针对茶鲜叶中有机磷残留检测的标准却仍为空白，但相关的非标准方法报道较多[11,16-19]。在使用标准方法或某些非标准方法检测有机磷残留时，样品的称量和前处理、溶液的配制等过程，都会对检测结果产生一定的影响。由于检测结果直接反映了茶产品质量的好坏，当使用这些结果作为决策依据时，科学评价结果的准确性尤为重要。测量不确定度是用于表征测量值分散性的参数，它定量地描述了测量值的可信区间，是评价检测数据质量高低的一项重要指标，检测结果的可靠性极大程度上取决于其不确定度的大小[20-21]。通过对分析方法中不确定度的评定，可以量化影响检测结果的主要因素，便于改进实验方案，使检测结果更加准确可信[22-24]。近年来，很多分析工作者对茶叶中有机磷农药检测的不确定度开展了研究。例如，罗发美[25]、李建珍[26]、李志[27]等分别对茶叶中草甘膦、乙酰甲胺磷、敌敌畏残留量检测的不确定度进行了评定，得出了影响不确定度的主要因素，为实验室改进和提高检测质量提供了依据。但是，对于茶鲜叶中有机磷残留检测的不确定度分析，目前国内外尚未见研究报道。

本研究在实验室前期建立的气相色谱-火焰光度检测器测定茶鲜叶中有机磷农药残留方法[16]的基础上，选择在我国茶树上登记使用及在茶叶中具有最大残留限量的有机磷农药[5,28]敌敌畏、乐果、马拉硫磷和杀螟硫磷为研究对象，依据《化学分析中测量不确定度评估指南》[29]和《测量不确定度评定与表示》[30]，对该方法测定茶鲜叶中4种有机磷农药残留量的不确定度进行评定，分析测定过程中不确定的来源，找出影响不确定度的主要因素，并提出针对性的控制方法，为正确评价和使用检测结果提供依据，同时也为茶鲜叶中其他农药残留检测的不确定度评定提供参考范例。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶鲜叶 按一芽二、三叶标准取自苏州东洞庭山碧螺春茶园，取样时间为2022年4月份，将样品充分粉碎、混匀，装入聚乙烯塑料袋，-20 ℃贮存，备用；有机磷农药标准品包括：敌敌畏、乐果、马拉硫磷和杀螟硫磷 质量浓度均为1000 μg/mL，农业部环境保护科研监测所（天津）；PSA吸附剂、GCB吸附剂 天津博纳艾杰尔公司；C18吸附剂 美国赛分公司；乙腈、丙酮、乙酸、无水乙酸钠、无水MgSO4分析纯，上海国药集团。

7890A气相色谱仪（配火焰光度检测器） 美国Agilent公司；JY20002电子天平 上海舜宇恒平科学仪器；KQ-500DE超声波清洗器 昆山超声仪器公司；CenLee16R高速离心机 湖南湘立公司；HSC-24 B氮吹仪 天津恒奥公司。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器检测条件 色谱柱：DB-1701毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气为高纯氮气，流速3.0 mL/min；氢气流速75 mL/min；空气流速100 mL/min；升温程序：90 ℃保持1 min，以20 ℃/min升温至200 ℃保持9 min，再以30 ℃/min升温至245 ℃保持8 min；进样口温度220 ℃；检测器温度245 ℃；进样量1.0 μL，不分流进样。

1.2.2 标准溶液配制 准确吸取4种有机磷农药标准品各1.0 mL于25 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配成浓度为40 μg/mL的单标溶液。根据各农药在检测器上的响应，取单标溶液敌敌畏0.5 mL、乐果2.0 mL、马拉硫磷和杀螟硫磷各1.0 mL于10 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，得混合标准中间液。然后用空白茶鲜叶基质溶液将该中间液逐级稀释成标准系列工作溶液，其中敌敌畏浓度为0.01、0.025、0.05、0.25、0.5、1.0 μg/mL，乐果浓度为0.04、0.1、0.2、1.0、2.0、4.0 μg/mL，马拉硫磷和杀螟硫磷浓度为0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 μg/mL。

1.2.3 样品处理 称取5.0 g茶鲜叶试样于50 mL离心管中，加入10 mL 1%乙酸的乙腈溶液和2 g无水乙酸钠，混匀，超声提取15 min，然后加入1 g无水MgSO4，涡旋2 min，9000 r/min离心4 min。移取4.0 mL提取液至装有0.15 g C18、0.15 g PSA、0.12 g GCB和0.3 g无水MgSO4的离心管中，涡旋2 min，9000 r/min离心5 min。移取2.0 mL净化液，在50 ℃水浴下氮吹近干，准确加入1.0 mL丙酮溶解残渣，经0.22 μm滤膜过滤后，滤液作为待测溶液，备用。

1.2.4 样品检测 用气相色谱-火焰光度检测器分析基质标准溶液，以农药的峰面积对其相应的质量浓度做标准曲线。采用同样的方法分析待测溶液，将测得的峰面积代入标准曲线，计算得到待测溶液的浓度，最后计算得到样品中农药的含量。

1.3 数据处理

采用Agilent Chemstation B.04.03[54]进行数据采集与处理，Microsoft Excel 2016和Origin 2019b进行数据统计、绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不确定度测定数学模型

根据方法测定原理和过程，茶鲜叶中4种被测农药残留含量按公式（1）计算[18]：

式中：X为茶鲜叶中农药的含量，mg/kg；ρ为由标准曲线计算得到的样品溶液中农药的浓度，mg/L；V为试样溶液的定容体积，mL；m为称取试样的质量，g；f为样品溶液的稀释因子，f=1。

2.2 不确定度来源分析

测量结果的不确定度由若干个分量组成，按其数值评定方法，分为A类和B类。A类评定是指采用统计方法对在规定测量条件下测得的量值进行的不确定度分量的评定，由重复性检测引入的不确定度属于A类不确定度。B类评定是指采用不同于A类评定方法进行的不确定度分量的评定，其信息来源一般包括生产厂的说明书、检定规程、校准规范、检定或校准证书提供的数据等[29-30]。

根据数学模型，茶鲜叶中4种有机磷农药残留量测定的不确定度来源包括：样品测定重复性引入的相对标准不确定度urel(X)；标准溶液配制引入的相对标准不确定度urel(S)；标准曲线拟合引入的相对标准不确定度 urel(Cur)；样品称量引入的相对标准不确定度urel(m)；样品提取、净化和定容等前处理过程引入的相对标准不确定度urel(V)；样品中农药添加回收率引入的相对标准不确定度urel(R)；仪器测定引入的相对标准不确定度urel(GC)。

2.3 不确定度分量的评定

2.3.1 样品测定重复性引入的相对标准不确定度urel(X)在重复性条件下，对已添加4种有机磷农药标准品的阳性茶鲜叶样品（敌敌畏、乐果的理论浓度分别为0.1 mg/kg和0.4 mg/kg，马拉硫磷和杀螟硫磷的理论浓度为0.2 mg/kg）进行前处理，平行测定6次。根据测得数据，采用A类评定，计算样品测定重复性引入的标准不确定度u (X)和相对标准不确定度 urel(X)，计算式分别为公式（2）和公式（3），结果见表1。由结果可知，茶鲜叶中4种被测农药由测定重复性引入的相对标准不确定度较小，其值在1.20×10-3～9.90×10-3之间，表明方法测定得到的数据具有良好的重复性，而在4种被测农药中，乐果测定重复性引入的不确定度最大，这主要是由于乐果在气相色谱检测过程中，在仪器进样口较容易发生吸附降解，从而增加了不确定的引入。

表 1 茶鲜叶中4种有机磷农药重复测定结果和不确定度Table 1 Repeatability test result and uncertainty of 4 organophosphorus pesticides in fresh tea leaves

2.3.2 标准溶液配制引入的相对标准不确定度urel(S)通过逐级稀释的方法将4种有机磷农药标准品稀释至工作浓度，该过程引入的不确定度主要来源于标准品质量浓度、标准中间液及标准工作溶液的稀释定容3个方面。

2.3.2.1 标准品质量浓度引入的相对标准不确定度urel(Sc)根据标准物质证书，敌敌畏、乐果、马拉硫磷和杀螟硫磷标准品的质量浓度（C）均为1000 μg/mL，扩展不确定度（Urel）分别为0.6、1.0、1.3和1.0 μg/mL，包含因子k=2，根据公式（4）计算4种农药标准品质量浓度引入的相对标准不确定度urel(Sc)依次为：敌敌畏乐果马拉硫磷杀螟硫磷

2.3.2.2 标准中间液稀释定容引入的相对标准不确定度 urel(Ss) 根据1.2.2节标准中间液的配制方法，该部分使用的量器为1 mL可调移液器及10 mL和25 mL A级容量瓶，产生的不确定度主要由移液器、容量瓶及温度变化对丙酮体积的影响共同引入。1 mL移液器移取0.5 mL和1 mL的容量允差分别为±0.005 mL和±0.01 mL[31]，按矩形分布和25 mL A级容量瓶的容量允差分别为±0.02 mL和±0.03 mL[32]，按三角形分布实验室环境温度为（20±5）℃，丙酮的膨胀系数为1.49×10-3/℃，按矩形分布计算各分量的相对标准不确定度，结果见表2。

敌敌畏标准中间液稀释定容过程中，使用1 mL移液器移取0.5 mL和1 mL各1次，10 mL和25 mL A级容量瓶各1次；乐果标准中间液稀释定容过程中，使用1 mL移液器移取1 mL 2次，10 mL和25 mL A级容量瓶各1次；马拉硫磷和杀螟硫磷标准中间液稀释定容过程中，使用1 mL移液器移取1 mL 1次，10 mL和25 mL A级容量瓶各1次。根据量器的使用次数，计算4种农药标准中间液配制引入的相对标准不确定度 urel(Ss)依次为：敌敌畏 urel(Ss,1)=1.19×10-2，乐果 urel(Ss,2)=1.19×10-2，马拉硫磷 urel(Ss,3)=9.48×10-3，杀螟硫磷

2.3.2.3 标准工作溶液稀释定容引入的相对标准不确定度u (Sw) 用空白茶鲜叶基质溶液将标准中间液逐级稀释定容至2 mL，得4种农药的不同浓度的标准工作溶液。此过程产生的不确定度主要由容量瓶、移液器的体积及温度变化所引入，均为B类评定。实验室环境温度为（20±5）℃，20 ℃时丙酮的膨胀系数为1.49×10-3/℃，按矩形分布容量瓶按三角形分布移液器按矩形分布依据检定规程[31-32]规定的容量误差，计算各分量的相对标准不确定度，结果见表3。

表 2 标准中间液配制过程中引入的不确定度Table 2 Uncertainty introduced by the preparation of standard intermediate solution

表 3 标准工作溶液配制过程中引入的不确定度Table 3 Uncertainty introduced by the preparation of standard working solution

在标准工作溶液的稀释定容过程中，使用2 mL A级容量瓶6次，1 mL移液器移取1 mL 4次，200 μL移液器移取0.2 mL 6次，则4种农药标准工作溶液稀释定容引入的相对标准不确定度urel(Sw)为：

将 urel(Sc)、 urel(Ss) 及 u(Sw)按公式（6）进行合成，计算4种农药标准溶液配制过程中的相对标准不确定度urel(S)依 次为：敌敌畏urel(S,1) =3.28×10-2，乐果urel(S,2)=3.28×10-2，马拉 硫磷 urel(S,3)=3.20×10-2，杀螟硫 磷

2.3.3 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(Cur)取1.2.2中配制的6个不同浓度水平的标准工作溶液上机测定，每个浓度测定2次，以标准溶液浓度X为横坐标，以色谱峰面积Y为纵坐标，采用最小二乘法拟合，得到4种有机磷农药的线性回归方程Y=AX+B（A为斜率，B为截距）和决定系数（R2）。根据测得的数据，按公式（7）和公式（8）计算由标准曲线拟合引入的标准不确定度u (Cur)和相对标准不确定度 urel(Cur)，结果见表4。从中可知，4种有机磷农药标准曲线拟合引入的相对标准不确定度均较大，在4.67×10-2～9.89×10-2之间，对合成不确定度的贡献率达到62.0%～86.7%（图1），是引起本方法测定时不确定度的主要因素，在实际测定工作中应进行重点控制。

图 1 4种有机磷农药不确定度分量在合成不确定度中的占比Fig.1 The proportion of uncertainties of 4 organophosphorus pesticides in combined uncertainties

表 4 标准曲线拟合引入的不确定度Table 4 Uncertainties resulting from standard curve fitting

式中： SR为标准溶液中农药峰面积残差的标准差，按公式（9）计算；A为拟合曲线的斜率；p为样品平行测定次数，p=6；n为标准溶液测定总次数，本实验中6个质量浓度重复测定2次，n=12；为样品溶液中农药的平均浓度，μg/mL；为标准溶液浓度的平均值；为标准溶液中农药浓度的测定值，μg/mL。

式中：B为拟合曲线的截距；A为拟合曲线的斜率；Yi,Std为标准溶液各浓度点对应农药的峰面积。

2.3.4 样品称量引入的相对标准不确定度urel(m) 称取茶鲜叶样品5.0 g，所用电子天平检定证书上标明其称量50 g以下质量范围的最大允差a为±0.05 g，天平去皮归零后再称量，操作两次得到样品的质量，采用B类评定，按矩形分布，取包含因子（k）为，则由样品称量引入的标准不确定u (m)和相对标准不确定度urel(m)为：

依据检定规程[31-32]对容量允差的规定，吸量管按三角形分布移液器按矩形分布实验室的温度为20 ℃，乙腈和丙酮的膨胀系数分别为1.37×10-3/℃和1.49×10-3/℃，室温在±5 ℃范围内波动，按矩形分布计算各分量的相对标准不确定度，结果见表5。

根据吸量管和移液器的使用次数，样品前处理引入的相对标准不确定度urel(V)为：

2.3.6 回收率引入的相对标准不确定度urel(R) 回收率作为衡量分析方法准确度的重要指标，无论检测结果是否折算回收率，其对检测结果的不确定度均存在显著影响[33]。在茶鲜叶阴性样品中加入4种有机磷农药混合标准溶液，进行6次添加回收试验。采用A类评定，分别按公式（13）和公式（14）计算回收率引入的标准不确定度u (R)和 相对标准不确定度urel(R)，结果见表6。从表中可知：本文所用方法对茶鲜叶中4种有机磷农药测定的回收率在95.8%～100.5%之间，具有较好的准确度。由4种农药回收率引入的相对标准不确定度在7.31×10-3～9.90×10-3之间，其中乐果回收率引入的不确定度最大，不同农药回收率引入的不确定存在差异，这与测定方法中农药的提取净化效率、样品基质及仪器测量状态等影响因素有关。

表 5 前处理过程引入的不确定度Table 5 Uncertainty caused in sample pretreatment

表 6 茶鲜叶中4种有机磷农药的添加回收率和不确定度Table 6 Recovery and uncertainty of 4 organophosphorus pesticides spiked fresh tea leaves

2.3.7 仪器测定引入的相对标准不确定度urel(GC)利用气相色谱仪测定茶鲜叶中4种有机磷农药的含量，根据仪器检定证书，其定量重复性的相对标准偏差（RSD）为1.4%，采用B类评定，按矩形分布则气相色谱仪测定引入的相对标准不确定度urel(GC)为：

2.4 相对合成标准不确定度urel(ω)

对上述各个相对标准不确定度分量进行汇总，结果见表7。由表7结果可见：A类评定时4种有机磷农药的不确定度分量存在差异，而B类评定时不确定度分量对所评定的4种农药基本一致，这是由于A类不确定度来自于系列测量结果的统计评定，而B类不确定度由仪器和设备的水平决定，与分析人员和测量次数无关。

表 7 各分量的相对标准不确定度Table 7 The relative standard uncertainty of each component

将各分量的相对标准不确定度代入公式（16）计算，则茶鲜叶中敌敌畏、乐果、马拉硫磷、杀螟硫磷的相对合成标准不确定度urel(ω)分别为0.106、0.0929、0.0932、0.0593。

图1为4种有机磷农药的不确定度分量在合成不确定度中的占比情况。从图中可以看出，7种不确定分量对合成不确定度的贡献存在较大差异，其中标准溶液配制、标准曲线拟合的不确定度占比总计达到90%以上，是合成不确定度的主要贡献因子，而其它分量的不确定度贡献较小可以忽略不计[34]。可见采用本方法测定茶鲜中4种有机磷农药时，标准溶液配制及标准曲线拟合是测定结果准确与否的关键。在实际检测分析中，可采取使用精度更高的量器、简化标准溶液的配制步骤、增加标准溶液的测定次数、选择合适的标准曲线浓度范围等措施，规避或减少由此引入的不确定度，从而提高结果的准确性。

2.5 扩展不确定度与检测结果表示

依据JJF 1059.1-2012[30]，在置信概率P=95%时，取包含因子k=2，根据表1中4种有机磷农药含量测定的平均值，按公式（17）计算扩展不确定度U，4种有机磷农药在茶鲜叶中的扩展不确定度见表8。

从表中可知，4种有机磷农药的扩展不确定度在0.021～0.073 mg/kg之间，从高到低依次为乐果＞马拉硫磷＞杀螟硫磷＞敌敌畏，其中乐果的扩展不确定度最大，这与其残留含量最高有关。茶鲜叶中4种有机磷农药残留量的检测结果可表示为：敌敌畏：0.096±0.021 mg/kg，k=2；乐果：0.39±0.073 mg/kg，k=2；马拉硫磷：0.19±0.036 mg/kg，k=2；杀螟硫磷：0.19±0.023 mg/kg，k=2。

表 8 茶鲜叶中4种有机磷农药的扩展不确定度Table 8 The expanded uncertainties of four organophosphorus pesticides in fresh tea leaves

3 结论

本文采用气相色谱外标法测定茶鲜叶中4种有机磷农药残留的含量，分析了该方法不确定度各个分量，对不确定度评定中的数学建模、分量计算及其合成与扩展等进行了研究。通过测定模拟阳性茶鲜叶样品，当置信概率为95%（k=2）时，检测结果可表示为：敌敌畏，0.096±0.021 mg/kg；乐果：0.39±0.073 mg/kg；马 拉 硫 磷：0.19±0.036 mg/kg；杀 螟 硫 磷：0.19±0.023 mg/kg。

从评估结果可以看出，标准溶液的配制及标准曲线的拟合是该方法不确定度的主要影响因素，其他因素的影响较小，可以不予考虑。依据本研究结果，建议在采用该方法检测茶鲜叶中有机磷农药时，应重点关注标准溶液的相关操作过程，通过使用精度更高的量器、简化标准溶液的配制步骤、增加标准溶液的测定次数、选择合适的标准曲线浓度范围等措施降低检测结果的不确定度。该评定结果为客观评价检测方法和结果的可靠性与准确性提供了参考。