金钗石斛花多酚的PEG 200提取工艺优化及体外抗氧化活性

赵洋洋，邢 杰，李 丽，詹茂玲，李 飞，林李芳洲，王 岚，杨文宇,

（1.西华大学食品与生物工程学院，四川成都 610039；2.贵州仙草生物科技有限公司，贵州赤水 564700）

金钗石斛花是一种药食两用的中药材[1]，为兰科植物Dendrobium nobileLindl.新鲜或干燥的花，其功效与金钗石斛茎相似[2]，具有强阴益气、厚肠胃、轻身延年、延缓衰老等作用，在其主产地贵州赤水常被用作保健食材，因产量远低于茎[3]，故十分名贵。目前有关金钗石斛的研究主要集中在茎[4]，对花的研究相对较少。食用花卉是生物活性多酚类物质的重要来源[5-6]，多酚类化合物在抗氧化[7]、抗菌[8]、抗癌[9]等方面有多种药用价值，对人体健康有积极作用。多酚的提取通常采用煎煮、回流、索氏提取等提取方法，所用溶剂除水外，普遍使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂[10]，故往往存在能耗高、影响环境、不便循环利用等问题，因此，开发绿色提取工艺至关重要。近年来，PEG作为新型绿色提取溶剂逐渐被重视，已在多酚类成分的提取方面得到一些应用[11-13]。PEG具有无毒、可食用、成本低、对环境友好等特点，且可循环利用，因此，以其作溶剂建立金钗石斛花多酚的绿色提取工艺，在经济性、安全性、环保性等方面具有优势，其酚类成分可以更好地用于食品及健康相关产品的开发。为实现金钗石斛花资源的进一步开发和利用，本研究以PEG 200为溶剂，通过响应面设计优化金钗石斛花多酚的提取方法，实现高效提取；利用大孔树脂吸附法回收多酚和PEG，重复利用提取介质以实现该方法的绿色可持续性，并对金钗石斛花总多酚的体外抗氧化性进行考察，为开发利用金钗石斛花资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金钗石斛花 贵州省赤水市复兴镇转石奇观景区，采收时间为2021年5月，经西华大学食品与生物工程学院杨文宇副教授鉴定为兰科植物金钗石斛（Dendrobium nobileLindl.）的花；2,2-联苯基-1-苦基肼基 上海麦克林生化科技有限公司；2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐 生工生物工程上海股份有限公司；抗坏血酸 分析纯，成都金山化学试剂有限公司；没食子酸标准品 色谱纯，成都埃法生物科技有限公司；PEG 200、PEG 400、PEG 600、无水乙醇、Folin-酚试剂（2 mmol·L-1）、碳酸钠

分析纯，成都市科隆化学品有限公司；AB-8型大孔树脂、D101大孔树脂、阳离子交换树脂 成都市科隆化学品有限公司。

UV-2600型紫外可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；HYN-2120C恒温摇床 天津欧诺仪器仪表有限公司；BT25S型1/10万电子天平 德国赛多利斯公司；SB-5200DTN型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司； SpectraMax i3x型多功能酶标仪 美谷分子仪器上海有限公司；Concentrator plus型低温真空离心浓缩仪 艾本德中国有限公司；LC-16高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金钗石斛花多酚的绿色提取工艺 选用不同分子量的PEG为提取溶剂，干燥的金钗石斛花打碎成粗粉过80目筛备用。精确称取石斛花粉末1 g，按实验设计提取条件，以超声波辅助提取法提取金钗石斛花多酚。根据唐静月等[14]的方法研究并做适当调整，采用10000 r·min-1、4 ℃离心30 min后取上清液得到金钗石斛花多酚粗提取液。

1.2.2 样品中金钗石斛花多酚得率的测定 提取液总酚含量利用Folin-酚比色法测定，根据李娟等[15]的方法并进行改进，取1 mL提取液于25 mL比色管中，加3 mL Folin-酚试剂，6.0 mL 12%碳酸钠溶液，振荡混匀，最后定容至25 mL，25 ℃下黑暗避光反应2 h，测定其在760 nm处的吸光值。没食子酸标准曲线绘制：制备0.1 mg·mL-1的没食子酸标准溶液，取标准溶液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL于25 mL比色管中，按上述步骤显色后依次测定各浓度的吸光值，绘得横坐标为没食子酸浓度、纵坐标为吸光度的没食子酸浓度与吸光度标准曲线，其回归方程为y=1.7687x-0.01349，R2=0.9992，拟合程度较好。按下列公式计算金钗石斛花多酚得率：

式中：Y表示金钗石斛花总多酚得率（mg·g-1）；C表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度（mg·mL-1）；D表示溶液稀释倍数；V表示供试品溶液体积（mL）；m表示取样量（g）。

1.2.3 提取工艺优化实验

1.2.3.1 单因素实验 超声波辅助提取金钗石斛花多酚，经查阅文献[16-17]和预实验后，确定对溶剂类型、液料比、超声时间、超声温度、溶剂体积分数5个因素进行单因素实验，以筛选出对总多酚的提取有显著影响的因素，首先考察PEG溶剂分子量对于金钗石斛花多酚提取效率的影响，配制不同分子量的PEG（200、400、600）溶液作为溶剂，按照液料比30:1、超声时间80 min、额定功率为300 W、超声温度50 ℃、溶剂体积分数60%为固定条件提取金钗石斛花多酚，筛选出实验范围内提取效率最高的PEG型号作为提取溶剂，研究某一因素时其余因素保持不变，分别考察液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 mL·g-1），超声时间（40、60、80、100、120 min），超声温度（30、40、50、60、70、80 ℃），溶剂体积分数（20%、40%、60%、80%、100%）对金钗石斛花多酚得率的影响。

1.2.3.2 响应面试验设计 在单因素实验基础上选取对金钗石斛花多酚提取效率影响较大的液料比、超声时间、超声温度、溶剂体积分数四个因素的三水平为自变量进行响应面优化试验，金钗石斛花多酚的得率（mg·g-1）为因变量，选取的四个因素编码分别为溶剂体积分数（A）、液料比（B）、超声时间（C）、超声温度（D），编码因素及水平见表1。

表 1 Box-Behnken设计因素水平Table 1 Levels of Box-Behnken design factor

1.2.4 金钗石斛花多酚的回收以及提取溶剂的重复利用 采用AB-8、阳离子交换树脂、D101三种大孔树脂进行金钗石斛花多酚的回收实验。取最优条件下的花多酚提取液5 mL三份，依次加入三种大孔树脂5 g，25 ℃下于摇床上振荡8 h（120 r·min-1），取其上清液测定多酚吸附率。选取吸附率最高的树脂进行进一步实验。滤液PEG 200再次用于金钗石斛花样品提取，测量并计算重复利用率。过滤得到大孔树脂置于过量甲醇中解吸4 h（25 ℃，120 r·min-1），取解吸液测定解吸率。

式中：m0表示吸附前样品中金钗石斛花多酚的含量（mg）；m1表示吸附后上清液金钗石斛花多酚的含量（mg）；m2表示解析后上清液金钗石斛花多酚的含量（mg）；m3表示再吸附后上清液中金钗石斛花多酚的含量（mg）。

1.2.5 体外抗氧化活性 金钗石斛花多酚清除DPPH及ABTS自由基的能力测定，以抗坏血酸为阳性对照，研究金钗石斛花多酚提取液对于DPPH以及ABTS自由基的清除能力。按照宋小蒙[4]的方法并进行改进，配制1 mmol·L-1DPPH储备液，100 μL DPPH储备液与100 μL样品混合，避光30 min后，检测517 nm处吸光度值，计算样品对于DPPH的清除率；按2:1的体积比将3.5 mmol·L-1ABTS与2.45 mmol·L-1的过硫酸钾混合，室温下避光15 h制备ABTS自由基储备液，取150 μL ABTS储备液和50 μL样液于96孔板中避光10 min，在734 nm处测量吸光值，计算样品清除ABTS自由基的能力。金钗石斛花多酚样品为PEG 200提取液，减压浓缩除去溶剂中的水分，将PEG样品与水按照一定的比例进行稀释，ABTS样品比例为0～1:9，DPPH样品比例为1:2～1:36（比值均为PEG 200粗提取液:水）。

式中：A0表示DPPH在517 nm处的吸光度；A1表示样品与ABTS自由基反应后在517 nm处的吸光度；A2表示样品空白在517 nm处的吸光度。

式中：A3表示ABTS自由基储备液在734 nm处的吸光度；A4表示样品与ABTS自由基反应后在734 nm处的吸光度；A5表示样品空白在734 nm处的吸光度。

1.3 数据处理

实验均平行重复三次，并使用Excel 2010软件收集和整理实验数据，使用Design-expert 8.0软件对实验数据采用方差分析进行比较。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 PEG分子量对金钗石斛花多酚得率的影响通过使用不同分子量的PEG作为溶剂来提取金钗石斛花多酚，由图1可以看出PEG的分子量对金钗石斛花多酚的得率存在一定的影响，PEG 200提取液中多酚的含量最高，且显著高于PEG 400和PEG 600（P＜0.05），其原因是聚乙二醇的相对分子质量越小，溶液的黏度越小，增加了热交换，有利于传质，在提取过程中，随着聚乙二醇相对分子质量的降低，溶液的极性增大[18]。因此选择黏度相对较小的PEG 200作为进一步试验的提取溶剂来进行考察。

图 1 PEG分子量对金钗石斛花总多酚得率的影响Fig.1 Effect of PEG molecular weight on the yield of DNF polyphenols

2.1.2 溶剂体积分数对金钗石斛花多酚得率的影响考察不同体积分数（20%、40%、60%、80%、100%）的PEG 200作为提取溶剂时对金钗石斛花多酚提取效率的影响，由图2可以看出当溶剂体积分数为60%时，多酚得率达到最高，提取效率较高。首先，随着体积分数的增加，PEG 200的溶解能力提高，金钗石斛花多酚的溶解度变大。后期，随着PEG 200浓度的增加，溶液黏度增大，溶剂的流动性可能会影响金钗石斛花多酚与植物中的多糖和蛋白质等物质的结合程度，影响提取液中多酚的含量，从而减缓了提取过程中的传质过程[19]。为进一步优化金钗石斛花多酚的提取方法，选择溶剂体积分数分别为40%～80%作为响应面优化试验的水平条件。

图 2 不同体积分数PEG 200对金钗石斛花总多酚得率的影响Fig.2 Effect of different concentrations of PEG 200 on the yield of DNF polyphenols

2.1.3 超声时间对金钗石斛花多酚得率的影响 考察不同超声时间（40、60、80、100、120 min）对金钗石斛花多酚提取效率的影响，由图3可以看出，随着超声时间的增加，提取液中金钗石斛花多酚含量随之增大，最后达到平衡，在实验范围内，当超声80 min时，提取液中金钗石斛花多酚含量达到最大，适宜的超声时间可以有效地溶出金钗石斛花中的多酚，提高金钗石斛花多酚得率，因此选择超声时间60～100 min作为响应面优化试验的水平条件。

图 3 不同超声时间对金钗石斛花总多酚得率的影响Fig.3 Effect of different ultrasound time on the yield of DNF polyphenols

2.1.4 超声温度对金钗石斛花多酚得率的影响 考察不同超声温度（30、40、50、60、70、80 ℃）对金钗石斛花多酚提取效率的影响，根据图4可以看出，温度的控制对于金钗石斛花多酚提取效率的影响较为复杂，可能是由于超声波清洗仪的水浴温度控制较为困难的原因，导致温度对于金钗石斛花多酚提取效率的影响线性关系复杂[20]，但是根据图4还是可以看出，当温度为70 ℃时，提取液中金钗石斛花多酚的含量最高，50与60 ℃的提取效率接近，因此为了进一步优化实验条件，选择60～80 ℃作为响应面优化试验的温度水平条件。

2.1.5 液料比对金钗石斛花多酚得率的影响 考察不同液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 mL·g-1）对金钗石斛花多酚提取效率的影响，根据图5可以看出，在实验范围内增大液料比的比值，提取液中多酚含量逐渐增大，在一定范围内增加溶剂的比例，更有利于金钗石斛花多酚的溶出，当比值为30:1 mL·g-1时，金钗石斛花多酚得率达到最大，因此为进一步优化实验条件，选择液料比20:1～40:1 mL·g-1作为响应面优化试验的液料比水平条件。

图 4 不同超声温度对金钗石斛花总多酚得率的影响Fig.4 Effect of different ultrasound temperature on the yield of DNF polyphenols

图 5 不同液料比对金钗石斛花总多酚得率的影响Fig.5 Effect of different liquid-solid ratio on the yield of DNF polyphenols

2.2 响应面试验

2.2.1 多元二次回归模型的建立及方差分析 根据单因素实验得到的水平条件，设计四因素三水平的Box-Behnken响应面试验，以提取液中金钗石斛花多酚含量作为响应值，记录试验结果，进行响应面分析，试验设计及结果见表2。

对响应面试验设计及结果进行回归分析得到拟合方程Y=297.50-5.37A+10.12B+7.74C+13.16D+8.76AB-13.80AD+13.93CD-17.78A2。

根据表3回归模型的方差分析表可以看出模型的P＜0.05，具有显著性，模型失拟项的结果并不显著（P＞0.05），R2=0.9745，Radj2=0.9530，该结果表明了试验设计结果具有可靠性，可以用来预测金钗石斛花多酚的含量。试验结果中D和A2都具有显著性（P＜0.05），表明各因素对于金钗石斛花多酚的提取效率并非简单的线性关系。几种因素对于金钗石斛花多酚提取效率的影响作用依次为：超声温度＞液料比＞超声时间＞溶剂体积分数。

表 2 Box-Behnken响应面试验设计结果分析Table 2 Analysis of design results about Box-Behnken response surface

表 3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2.2 响应面分析 根据各因素交互作用的响应面图6可以看出，开始时，金钗石斛花多酚的含量随溶剂浓度以及液料比的增大而增大，达到中心值后，多酚含量有所减小。溶剂体积分数（A）和液料比（B）、超声温度（D）和溶剂体积分数（A）、超声时间（C）和超声温度（D）之间均存在一定的交互作用，根据等高线的疏密程度可以看出超声时间和超声温度（CD）、溶剂体积分数和超声温度（AD）之间的交互作用更为明显。图6中A为溶剂体积分数（%），B为液料比（mL·g-1），C为超声时间（min），D为超声温度（℃），Y为金钗石斛花总多酚得率（mg·g-1）。

图 6 各因素相互作用响应面图Fig.6 Response surface plot of the interaction between various factors

2.2.3 优化结果与实验验证 根据Design-expert 8.0软件设计的响应面优化试验结果中得到PEG 200提取金钗石斛花多酚的工艺条件为溶剂体积分数55%，液料比38:1 mL·g-1，超声时间99 min，超声温度80 ℃，超声功率为300 W，预测总多酚含量应达到341.12 mg·g-1。根据以上得到的实验条件进行了三组实验，通过验证实验测定得到多酚含量为338.88 mg·g-1，与预测多酚含量接近，相对误差在0.7%内，实验结果可靠。

2.3 不同提取方法的比较

近年来文献报道的石斛花化学成分提取主要使用甲醇和乙醇[21-22]作为溶剂。在相同的最佳提取条件下，对70%甲醇、70%乙醇和55% PEG 200进行了对比实验，以证明PEG 200作为有效提取溶剂的可行性。采用传统方法（70%乙醇）的提取效果（128.63±0.63 mg·g-1）低 于 本 文 中 该 提 取 工 艺（338.88±0.25 mg·g-1），使用70%甲醇的提取效果（344.76±0.44 mg·g-1）略高于本文提取工艺，原因是PEG 200是一种比乙醇略强的极性溶剂，能更有效地提取更多的极性多酚类化合物。有研究表明，其在PEG中的化学选择性显著高于乙醇，是由于PEG的结构与多酚类化合物可能形成一种分子络合物[23]；由于甲醇的黏度远低于55%的PEG 200水溶液，有利于提取过程中的扩散和传质。但由于甲醇具有挥发性和易燃性，对环境有害。因此本文提取工艺高效且绿色，可用于提取金钗石斛花多酚。

2.4 总酚的回收和PEG 200循环利用

PEG 200的一个重要优点就是绿色环保，可重复利用。目前主要使用超临界CO2萃取[24]、固相萃取[25]、色谱[26]等方法回收提取物来再次利用溶剂，此类方法成本较高且操作复杂。利用大孔树脂吸附法[27]回收溶剂被认为是一种简便而高效的方法，可普遍用于回收PEG 200。本研究采用AB-8、阳离子交换树脂、D101三种不同类型大孔树脂来吸附PEG 200中的多酚，来研究多酚类物质的回收和PEG 200的重复利用性能，结果如图7所示。结果表明，三个不同类型的树脂吸附率都较好。在相同吸附剂用量和液料比的条件下，吸收效果从高到低依次为AB-8＞D101＞阳离子交换树脂，其中AB-8在液料比为5:5 mL·g-1时吸附率达到68.85%。再采用甲醇对已经吸附饱和的树脂进行解吸，在同等条件下，AB-8解析率最高，为81.82%。因此PEG 200经过大孔树脂吸附金钗石斛花多酚后，利用PEG 200与水沸点差异大通过旋转蒸发除去水分，实现循环利用。在最优实验条件下AB-8吸附后的PEG 200再次用于提取金钗石斛花多酚时，其得率为（420.59±2.80） mg·g-1，扣除吸附不完全带来的背景影响，其回收利用率达到79.06%。因此，PEG 200使用大孔吸附树脂回收后，性质稳定溶解性保持较好，可重复利用，是一种绿色优良的提取溶剂。

图 7 不同种类树脂的多酚吸附效率Fig.7 Polyphenol adsorption efficiency of different kinds of resins

图 8 金钗石斛花提取液和抗坏血酸的ABTS自由基清除能力Fig.8 ABTS free radical scavenging ability of DNF extract and VC

2.5 体外抗氧化活性

根据图8和图9可以看出，随着稀释倍数减小，金钗石斛花提取液中多酚的质量浓度提高，对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力也逐渐提升，因此表明其体外抗氧化活性较强。经测得该工艺下金钗石斛花粗提取液中多酚的质量浓度为16.974 mg·mL-1。根据图8可以看出金钗石斛花多酚提取液在实验比例范围内与浓度在0.1～0.5 mg·mL-1抗坏血酸的ABTS自由基清除能力逼近，当ABTS自由基的清除率为99%以上时，金钗石斛花多酚提取液的浓度为16.974 mg·mL-1。石斛花多酚浓度在1.886～5.657 mg·mL-1（1:8～1:2）内，清除率呈现良好的线性关系，拟合方程为y=0.1395x-0.1258，R2=0.9615，IC50=4.486 mg·mL-1。根据图9可以看出金钗石斛花多酚提取液在实验比例范围内的DPPH自由基清除能力逼近于浓度在0.03～0.30 mg·mL-1抗坏血酸，当达到90%以上的DPPH自由基清除率时，金钗石斛花多酚提取液浓度为1.886 mg·mL-1。金钗石斛花多酚浓度在0.339～1.886 mg·mL-1（1:40～1:8） 内，与DPPH的清除率具有良好的线性关系，拟合方程为y=0.0710x+0.3018，R2=0.9894，IC50=2.792 mg·mL-1。说明金钗石斛花多酚的DPPH及ABTS自由基清除能力较为明显。

3 讨论与结论

本文研究了一种金钗石斛花多酚的绿色提取工艺，PEG 200水溶液作为一种绿色溶剂可用于药用植物中活性成分的提取分离，利用超声波辅助提取效率提高，能快速破坏植物组织，加快有效成分的溶出，并利用大孔树脂AB-8吸附多酚回收溶剂。处理后的PEG 200对总酚仍具有较高的得率，回收利用率达79.06%。与传统的提取方法相比，该方法可以提供更高的提取产率，同时大大减少了提取时间和溶剂消耗，同时实现溶剂重复利用，可成为具有工业应用前景的提取工艺。且PEG是一种可食用食品添加剂，不仅价格低廉而且作为低共熔溶剂的材料被广泛使用[28]，以PEG作为溶剂不仅安全、环保而且极其稳定[29-30]，许多天然产物的活性成分成功地被PEG溶出，而且得率高于其他种类的溶剂，例如，对黄酮类化合物的提取效率高于乙醇和甲醇[31-32]，对多糖类物质的提取效率也高于水[29]，因此，PEG 200水溶液作为一种绿色溶剂在天然来源的多种活性物质的超声波辅助提取中显示出巨大的应用前景。

本研究可以为金钗石斛花多酚的绿色提取工艺提供可靠的数据，并为金钗石斛花多酚研发成为天然抗氧化剂提供了依据。目前就金钗石斛花的研究还比较少，金钗石斛花其他种类的活性成分和多酚的其他药理功能以及毒理等还有待进一步考察；PEG作为提取天然产物活性物质的环保溶剂选择性较差，对于极性较大的物质均具有良好的提取效率，因此PEG提取液中多酚类、黄酮类和多糖类物质的分离有待进一步研究。