一株沙福芽孢杆菌的耐受性研究

张海艳，杨伟平，杨婷婷

（洛阳师范学院 生命科学学院，河南 洛阳 471934）

近几年化学肥料的过量施用使得农作物对各种病虫害的抵抗能力越来越弱，导致农作物产量下降，品质降低[1-2]。在建设和发展绿色农业的新思路和新模式下，需创新和发展新的施肥技术，减少化学肥料的施用量。生物堆肥主要是在农作物秸秆中加入益生菌发酵制成的肥料，适用于各种土壤，可增加土壤中有机物的含量、改善土壤通透性、提高地力，有利于农作物生长[3]。实施微生物堆肥技术，对挖掘有机肥新肥源、增强农作物抗性、提高农作物产量等都具有十分重要的意义[4-6]。芽孢杆菌属于细菌的一科，是一种常用的微生态制剂，其形成的芽孢对环境有很高的抗逆性，对高温、强酸和强碱都有一定的耐受能力。沙福芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，应用广泛，除应用于产IAA、固氮、溶磷[7]、产纤溶酶[8]和微生态饲料制剂[9]外，还应用于草鱼养殖水质调控、生物防治植物病害[10]、修复土壤重金属污染等方面[11]。袁慎亮等[8]筛选出一株能降解纤维蛋白的沙福芽孢杆菌，是一株新的纤溶酶产生菌，纤溶酶有较好的活性及稳定性，具有潜在的开发价值。徐同伟等[10]把沙福芽孢杆菌应用到生物防治病害方面，筛选出的沙福芽孢杆菌对烟草具有优良的防病和促生长作用，在降低烟草黑胫病危害和提高烟草产量方面具有重要作用，在对峙培养中沙福芽孢杆菌对烟草黑胫病菌丝的相对抑制率是72.99%，在盆栽试验中沙福芽孢杆菌对烟株生物量有明显的促生长作用，对烟草黑胫病的平均防治效果为80.06%。田群等[11]将沙福芽孢杆菌应用到修复土壤重金属（锰）污染方面，发现其修复效果好、成本低。但在农业生产中芽孢杆菌存在发酵周期较长、芽孢形成率较低、成本高等问题。基于以上，本文以沙福芽孢杆菌为研究对象，对其生长特性、耐酸碱性、耐热性及对抗生素的耐性进行了研究，并探究使该菌株芽孢形成率及芽孢数量最大化的培养条件。

1 试验材料

1.1 菌株

沙福芽孢杆菌由洛阳师范学院生命科学学院动物营养与健康研究室提供。

1.2 培养基

LB固体培养基、LB液体培养基及发酵培养基参照文献配制[12-13]。

2 试验方法

2.1 菌种活化

在超净工作台上用灭过菌的接种环挑取实验室保存的适量菌种，用平板划线法接种到无菌LB固体培养基中，在恒温培养箱中培养24 h。挑取单个菌落到LB液体培养基中，在37 ℃、220 r/min条件下摇床培养12 h。

2.2 种子液制备

吸取活化后的菌液1 ml，12 000 r/min离心2 min，弃上清液，加1 ml PBS摇匀后离心2 min，弃上清液，加1 ml PBS摇匀后用酶标仪测OD值，取OD600=0.5的菌液为种子液。

2.3 生长曲线制备

取种子液以1%的量接种至LB液体培养基，在37 ℃、转速220 r/min的摇床中培养6 h后测OD600值，以后每隔4小时吸取1 ml菌液测OD值，制备菌种的生长曲线。

2.4 计算不同温度水浴后的活菌数和存活率

将培养菌液分别放置于不同温度（37 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃）的水浴锅内加热10 min，以常温下的发酵培养液为空白对照，计算不同温度水浴后的活菌数和存活率。

2.5 计算不同pH值下的活菌数和存活率

吸取1 ml在中性条件下培养的菌液分别接种于pH值为2、4、6、7、8、9、10的不同发酵培养基中，37 ℃、220 r/min条件下摇床培养2 h，测量活菌数和存活率。

2.6 测定不同装液量下的活菌数

将种子液接种到不同装液量（25 ml、50 ml、75 ml、100 ml、125 ml、150 ml）的发酵培养液中，37 ℃、220 r/min条件下摇床培养12 h，测量不同装液量下的活菌数，然后将不同装液量的培养菌液放置于80 ℃的水浴锅内加热10 min，测定芽孢数。

2.7 计算不同初始pH值下的产孢率

参照文献将pH为7作为空白对照组[14-16]，将种子液接种到初始pH为5.5、6、6.5、7、7.5、8的培养液中，摇床培养12 h后测量活菌数和芽孢数，并计算芽孢率。

2.8 计算不同培养时间下的活菌数和产孢率

设置培养时间为6 h、12 h、24 h、36 h、48 h，在不同培养时间后测量菌株的活菌数和芽孢数，并计算芽孢率。

2.9 判定抗生素对沙福芽孢杆菌抗逆性的影响

将赤霉素、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素3种抗生素稀释成不同浓度的溶液[17]，先往培养皿中倾注一定量的菌液和稀释后的抗生素，然后加入40 ℃左右的LB固体培养基，并迅速混匀，培养基凝固后放入恒温培养箱中培养24 h。分别计算菌落数，菌落数少于5个的药物浓度为菌株的最大耐受浓度。

3 结果与分析

3.1 生长曲线

从图1可以看出，菌落培养6～22 h时菌株生长速度最快，呈指数增长，此时生长速度大于死亡速度。菌株培养22～30 h时处于生长稳定期，生长速度等于死亡速度，但此时活菌数最多。培养时间为30～50 h时菌体死亡速度大于生长速度，菌株数量明显下降。

3.2 温度对活菌数和存活率的影响

从图2可以看出，随着温度的升高，沙福芽孢杆菌的活菌数和存活率均逐渐下降，但在处理温度为90 ℃和100 ℃的高温条件下存活率分别为84.7%和84%，可见沙福芽孢杆菌具有较好的耐高温能力。传统的高温堆肥发酵温度为55～60 ℃，近年来快速发展的超高温堆肥技术的显著特点是温度高，最高温度达93.4 ℃[18]。从对温度的耐受力方面来看，沙福芽孢杆菌既能用于传统的堆肥技术，也能用于现代的超高温堆肥技术。

图2 温度对活菌数和存活率的影响

3.3 pH对活菌数和存活率的影响

从图3可以看出，随着pH的升高，沙福芽孢杆菌的活菌数和存活率都呈现先升高后降低的趋势，pH为7时活菌数和存活率均达到最高水平，在pH为2和10的条件下培养2 h后存活率分别为85.3%和83.8%，说明沙福芽孢杆菌具有较强的酸碱耐受能力。

图3 pH对活菌数和存活率的影响

3.4 装液量对活菌数和产孢率的影响

从图4可以看出，装液量为150 ml时产孢率最大，但活菌数量不是最大；装液量为100 ml时能获得最大活菌数；装液量为125 ml时能获得最大芽孢数。故以125 ml为最适装液量。

图4 装液量对活菌数和产孢率的影响

3.5 初始pH对活菌数和产孢率的影响

从图5可以看出，在一定范围内芽孢数随着pH的升高而升高，当pH为7时能获得最大芽孢数，pH大于7时芽孢数开始下降，故最适初始pH值为7。

图5 初始pH对活菌数和产孢率影响

3.6 培养时间对活菌数和产孢率的影响

从图6可以看出，活菌数随着培养时间的增加先增加后减少，活菌数和芽孢数均在培养24 h时达到最大，故以24 h为最佳培养时间。

图6 培养时间对活菌数和产孢率的影响

3.7 抗生素对沙福芽孢杆菌抗逆性的影响

从表1可以看出，沙福芽孢杆菌对高浓度的赤霉素有抗性，对低浓度的硫酸链霉素和硫酸卡那霉素有抗性。

表1 沙福芽孢杆菌对抗生素的耐受性

4 结论与讨论

该株芽孢杆菌的最佳产孢条件为培养温度37 ℃、培养时间24 h、初始pH=7、装液量125 ml，在此条件下菌株的芽孢数和活菌数均能达到最大；该菌株对赤霉素、硫酸链霉素和硫酸卡那霉素均具有一定的抗性。虽然通过优化培养条件能够提高沙福芽孢杆菌的芽孢形成率，缓解化学肥料造成的环境污染问题，但真正将微生物应用于生物堆肥时能源物质和营养供应直接影响其在土壤中的繁殖。为实现复合微生物堆肥的广泛应用，还需进一步深入研究不同土壤对芽孢萌发的影响，提高微生物对土壤的适应性、有效性和长效性。