圈养大熊猫和小熊猫所食两种新鲜竹叶的气味及成分研究

鲜义坤，董超，杨波，武伟，张亚辉*，刘张育，马黎民，张贵权*

（1.四川省自然资源科学研究院，成都 610041；2.大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和草原局重点实验室，成都 611830；3.中国大熊猫保护研究中心，成都 611830；4.成都大帝汉克生物科技有限公司，成都 611130；5.四川省动物采食调控工程技术研究中心，成都 611130；6.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118）

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）和小熊猫（Ailurus fulgens）分别为我国的一级和二级重点保护动物，在野外生存环境中同域分布，相互伴生，食性均已高度特化，都以竹类为主要食物，均食竹笋与竹叶，大熊猫还食竹秆，而小熊猫却不食竹秆[1-2]，对不同竹种的食物都存在明显的选择性[2-4]。在人工饲养条件下，大熊猫和小熊猫除竹秆外同食一样的窝窝头、苹果、胡萝卜、竹笋和竹叶，仅每天饲喂量有所不同。因大熊猫和小熊猫颇具观赏性和科研、科普价值，近些年人工饲养的数量、单位和地方越来越多。一些科研人员曾探索过圈养大熊猫选择性摄食的气味机理[5-7]，系统性研究过圈养大熊猫幼仔喜食的母乳、补饲奶粉，亚成体和成体所食的特制窝窝头、新鲜果蔬类食物、多种新鲜竹类食物和不食的阴干斑苦竹叶等气味特点及香气成分[7-14]，但未见圈养小熊猫、刺黑竹叶和八月竹叶在这些方面的专门研究报道。

经摄食行为观察，圈养大熊猫和小熊猫都要先嗅闻竹叶散发出的气味，然后才取食或不取食，说明竹叶的气味与圈养大熊猫和小熊猫是否愿意取食相关联。本文通过专业人员的嗅感品评、顶空（HS）-固相微萃取（SPME）-气相色谱（GC）-质谱（MS）联用分析法研究圈养大熊猫和小熊猫所食刺黑竹鲜叶、八月竹鲜叶的气味特点、挥发性有机物（VOCs）与典型香气成分，以探寻大熊猫和小熊猫共同喜好的食物气味特点，进一步挖掘大熊猫食物中的香气物质，为研制大熊猫和小熊猫的竹叶诱食剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试竹种

刺黑竹（Chimonobambusa purpurea）当地俗称牛尾竹，产于四川省崇州市文井江镇，竹龄3年，叶龄1～2年。八月竹（Chimonobambusa szechuanensis）产于四川省汶川县三江镇，竹龄2年，叶龄2个月～1年。均经专家鉴定并确定学名，是中国大熊猫保护研究中心卧龙神树坪基地和都江堰基地常喂大熊猫和小熊猫的竹种。

1.2 竹叶样品的采集、制备、保存和运输

2022年3 月下旬至7月初，先后在中国大熊猫保护研究中心卧龙神树坪基地和都江堰基地进行圈养大熊猫和小熊猫的上述2种竹叶饲喂试验，通过饲喂试验现场随机多点从竹枝上采集新鲜竹叶样品，所采样品可代表大熊猫和小熊猫所食的新鲜竹叶（以下简称鲜叶）。在鲜叶样品采集和制备之前，所有与样品接触的用具用品须经反复清洗，达到干净无味，以防其他气味串入样品。将多次采回的鲜叶样品混合，从中随机取出部分鲜叶，剪细，再混合，随机分成2份，装入自封塑料袋，分别用于气味品评和HS-SPME-GC-MS联用分析。制好的样品密封保存于-18℃冰箱中。采集的大样和制备的小样分别在装有冰袋的保温箱和桶中运输。

1.3 气味品评方法

在同一天分别称取刺黑竹和八月竹的鲜叶样品各0.8 g，倒入干净无味的50 mL玻璃烧杯中，每位专业品评小组成员（n=7）在不知样品有关信息的情况下单独嗅感并分辨竹叶自然散发出的多种气味韵调及其相对强弱，品评的主要香气指标参照Clive分类法的香气类型设立[15]，室内气温为24℃，具体方法参见文献[5-7]。相对强弱采用10分定义的标度方法计分：0=不存在的；2=微微的；4=轻微的；6=明确的；8=显著的；10=非常显著的[7-8]。每个品评指标的最终得分结果是去掉1个最高评分和1个最低评分后的算术平均数（n=5）。

1.4 HS-SPME-GC-MS联用方法

1.4.1 分析仪器

GC-MS联用仪（Agilent 7890B-5977B）、超高惰性石英毛细管色谱柱（HP-INNOWax、30 m×0.25 mm×0.25 μm）、20 mL顶空瓶及其相应的密封垫和铝盖，均由美国Agilent公司制造。SPME纤维头（75 μm CAR/PDMS）和手动进样手柄，均由美国Supelco公司制造。以上仪器设备由中国科学院成都分院分析测试中心GC-MS室提供。

1.4.2 HS-SPME方法

在同一天分别称取刺黑竹和八月竹的鲜叶样品各1.5 g，置于20 mL顶空瓶中，在70℃的条件下顶空萃取1 h。具体方法参见文献[5]。

1.4.3 GC-MS方法

GC条件：进样口温度为250℃，载气为高纯氦气，柱流量为0.80 mL·min-1，进样模式为分流，分流比为5∶1。程序升温模式：起始温度45℃，保持3 min，以5℃·min-1速率升至180℃，然后再以8℃·min-1速率升至260℃，保持10 min。MS条件及其数据处理同文献[9]的方法二。

1.5 数据统计分析

所得数据使用GranphPad Prism 8.0.2软件进行统计分析，P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 气味的嗅感品评

2.1.1 整体气味指标

经专业人员的品评打分，刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶的3个整体气味指标得分“均值±标准误”见图1。

由图1可知，刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶共有的整体气味特点为：气味较浓，愉悦度较高，透发性较强。经t检验，刺黑竹鲜叶的气味强度和愉悦度均显著低于八月竹鲜叶（P＜0.05），刺黑竹鲜叶的气味透发性虽然低于八月竹鲜叶，但差异不显著（P＞0.05）。

图1 两种竹子鲜叶整体气味指标的品评得分

2.1.2 主要香气指标

经专业人员的品评打分，刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶的4个香气指标得分“均值±标准误”见图2。

由图2可知，刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶共有的主要香气特点为：青香显著，均有轻微的甜气、微微的木香和很弱的油脂气。虽然刺黑竹鲜叶的青香、甜气低于八月竹鲜叶，但刺黑竹鲜叶的木香、油脂气高于八月竹鲜叶，除刺黑竹鲜叶的木香显著高于八月竹鲜叶（P＜0.05）外，其余3种香气的差异均不显著（P＞0.05）。

图2 两种竹子鲜叶主要香气指标的品评得分

2.1.3 主要韵调指标

经专业人员的品评打分，刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶的3个韵调指标得分“均值±标准误”见图3。

由图3可知，刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶共有的主要韵调特点为：新鲜感显著，均有明显的多汁感和不同程度的嫩感。刺黑竹鲜叶的新鲜感、多汁感、嫩感均明显低于八月竹鲜叶，其中新鲜感和多汁感的差异显著（P＜0.05），嫩感的差异达到极显著水平（P＜0.01）。

图3 两种竹子鲜叶主要韵调指标的品评得分

2.2 VOCs

刺黑竹和八月竹的鲜叶样品散发出的VOCs经HS-SPME-GC-MS联用法分析后，总离子流色谱图分别见图4和图5。

图4 圈养大熊猫和小熊猫所食刺黑竹鲜叶的VOCs总离子流色谱

从图4与图5的相互对比可以看出，刺黑竹鲜叶与八月竹鲜叶之间的出峰时间多数相同，但波峰大小有所差异，说明这2种鲜叶的VOCs成分有些相同，但相对含量有所不同。解谱后的具体成分及其相对含量详见表1。

图5 圈养大熊猫和小熊猫所食八月竹鲜叶的VOCs总离子流色谱

由表1可知，从刺黑竹和八月竹的鲜叶中测出的VOCs成分总数分别为53种和62种，这些VOCs成分及其相对含量各自归属于有机化合物的类别见表2。

表1 圈养大熊猫和小熊猫所食刺黑竹鲜叶与八月竹鲜叶中的VOCs %

由表2可知，从刺黑竹和八月竹的鲜叶中分别测出了8类和9类有机化合物。按每个类别测出的成分种数多少排序，前3位的类别在刺黑竹鲜叶中分别是醛类、醇类、酮类；在八月竹鲜叶中分别是烯烃类、醇类、醛类。按仪器自动算出的每类相对含量多少排序，前3位的类别在刺黑竹鲜叶中分别是醛类、醇类、酮类；在八月竹鲜叶中分别是醇类、烯烃类、醛类。由上可知，刺黑竹鲜叶与八月竹鲜叶之间在有机化合物类别的数量、各类的成分种数和相对含量上均存在或多或少的差异，可能因竹种、叶龄、产地等不同所致。

表2 刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶中VOCs的类别及其成分种数与相对含量统计

续表1圈养大熊猫和小熊猫所食刺黑竹鲜叶与八月竹鲜叶中的VOCs %

续表1圈养大熊猫和小熊猫所食刺黑竹鲜叶与八月竹鲜叶中的VOCs %

2.3 典型香气成分

典型香气成分是指我国或/和欧盟、美国、日本法规许可的食品级单体呈香物质，并非所有的VOCs或具有气味的VOCs。从刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶测出的VOCs中挑选出的典型香气成分详见表1中VOCs名称后面带☆者和△者。据统计，刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶分别有44种和45种典型香气成分，占各自VOCs成分总数的83.02%和72.58%，说明在这2种竹子鲜叶中大多数的VOCs属于典型香气成分，这可能是气味强度较大和香气类型丰富的物质基础。这些典型香气成分及其相对含量各自归属于有机化合物的类别见表3。

表3 刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶中典型香气成分的类别及其成分种数与相对含量统计

由表3可知，从刺黑竹和八月竹的鲜叶中测出的典型香气成分分别有7类和8类有机化合物。按每个类别测出的典型香气成分种数多少排序，前2位的类别在刺黑竹鲜叶中分别是醛类和醇类，这2个类别的成分数量之和达22种，在典型香气成分总数中占比50%；在八月竹鲜叶中分别是醇类和醛类，这2个类别的成分数量之和为20种，在典型香气成分总数中占比44.44%。按仪器自动算出的每类相对含量多少排序，前2位的类别在刺黑竹鲜叶中分别是醛类和醇类，这2个类别的相对含量之和达60.24%；在八月竹鲜叶中分别是醇类和醛类，这2个类别的相对含量之和达54.94%。由上可知，无论成分种数还是累计的相对含量，醛类和醇类典型香气成分是刺黑竹和八月竹鲜叶中香气类型及其相对强度的主要贡献物质类别。刺黑竹和八月竹的鲜叶中相对含量排前10位的典型香气成分见表4。由表4可知，在相对含量排前10位的典型香气成分中刺黑竹和八月竹的鲜叶之间有5种相同成分，分别是反式-2-己烯醛、2-乙基呋喃、3-己烯-1-醇、反式,反式-2,4-己二烯醛、反式,反式-2,4-庚二烯醛，这些相同成分是这2种鲜叶具有相同香气类型的物质基础，其累计相对含量分别达到38.18%和41.03%，预示八月竹鲜叶的气味强度应高于刺黑竹，与专业人员的品评结果相符（见图1）。其余为互不相同的成分，可能因为竹种、叶龄、产地等不同所致，可引起各香气类型的强度差异。

表4 刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶中相对含量排前10位的典型香气成分异同

3 讨 论

3.1 刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶香气形成的物质原由

综上所述，本研究不仅通过专业人员对圈养大熊猫和小熊猫所食刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶的整体气味特点、主要香气特点、主要韵调特点进行了品评，而且使用与气味物质测定相匹配的HSSPME-GC-MS联用法分析了这2种竹子鲜叶的VOCs，尤其是典型香气成分，进而以仪器分析的结果来证实专业人员的嗅感品评结果。尽管某些典型香气成分及其有机化合物类别的测定可能还不完全，但或多或少能说明这2种竹子鲜叶香气形成的直接物质原由。由表1可知，某种单一典型香气成分可呈现多种香气[16-19]，图2中的主要香气可从表1单一典型香气成分的主要香气特征中找到相应的多种支撑物质，因此这2种竹子鲜叶散发出的某种香气并非由一种典型香气成分形成，而是由多种典型香气成分在呈香相互作用（协同增效或抵消减弱[20]）后的最终嗅感结果。某种香气及其强度与典型香气成分的种数多少、含量和嗅感阈值高低密切相关[15]。由表1可知，与青香相关的典型香气成分在刺黑竹鲜叶中测出了24种，相对含量累计为55.86%；在八月竹鲜叶中测出了23种，相对含量累计为71.54%；无论典型香气成分种数还是累计的相对含量在这2种竹子鲜叶品鉴出的4种香气类型中最多，故青香最强，与图2的品评结果相符；虽然刺黑竹鲜叶中测出的典型香气成分种数比八月竹鲜叶多1种，但累计的相对含量却少15.68个百分点，这可能是刺黑竹鲜叶的青香不及八月竹鲜叶浓的原因。与甜气相关的典型香气成分在刺黑竹鲜叶中测出了14种，相对含量累计为23.17%；在八月竹鲜叶中测出了13种，相对含量累计为27.60%；测出的典型香气成分种数和累计相对含量在这2种竹子鲜叶品鉴出的4种香气类型中均位居第二，故甜气的浓度在这2种竹子鲜叶中均排名第二，也与图2的品评结果相符；虽然刺黑竹鲜叶中测出的典型香气成分种数比八月竹鲜叶多1种，但累计的相对含量却少4.43个百分点，这可能是八月竹鲜叶的甜气比刺黑竹鲜叶强的原因。与木香相关的典型香气成分在刺黑竹鲜叶中测出了9种，相对含量累计为20.68%；在八月竹鲜叶中测出了8种，相对含量累计为23.46%；测出的典型香气成分种数和累计相对含量在这2种竹子鲜叶品鉴出的4种香气类型中均位居第三，故木香的浓度在这2种竹子鲜叶中均排名第三，同样与图2的品评结果相符；虽然刺黑竹鲜叶中测出的典型香气成分种数比八月竹鲜叶多1种，而累计的相对含量少2.78个百分点，似乎八月竹鲜叶中的木香比刺黑竹鲜叶强，这与专业人员的品评结果不一致，但刺黑竹鲜叶中与木香相关的反式-β-紫罗兰酮相对含量最高（4.77%，见表1），其香气阈值为0.007 μg·kg-1[15]；而八月竹鲜叶中与木香相关的β-罗勒烯相对含量最高（16.54%，见表1），其香气阈值为34 μg·kg-1[21]，即反式-β-紫罗兰酮的香气阈值是β-罗勒烯的4 800余倍，香气阈值越低，香势越强[15]，极大地提升了刺黑竹鲜叶中木香的嗅感品评结果，因此刺黑竹鲜叶中的木香比八月竹鲜叶强；供试刺黑竹鲜叶的叶龄比供试八月竹鲜叶的叶龄大，叶龄越大，木质化程度越高，木香就越强，这也佐证了刺黑竹鲜叶中的木香比八月竹鲜叶强。如前所述，在典型香气成分的有机化合物类别方面，醛类和醇类典型香气成分是刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶气味的主要贡献物质类别，与文献[6-7]报道的圈养大熊猫所食毛竹、牛儿竹、硬头黄竹、清甜竹、孝顺竹、斑苦竹等6种鲜叶结果一致。

3.2 圈养大熊猫和小熊猫摄食新鲜竹叶的主要气味指标适宜范围

综上所述，刺黑竹鲜叶的气味强度、愉悦度、透发性、青香、甜气、新鲜感、多汁感和嫩感均低于八月竹鲜叶，而刺黑竹鲜叶的木香和油脂气均高于八月竹鲜叶，其中气味强度、愉悦度、木香、新鲜感和多汁感的差异显著（P＜0.05），嫩感的差异极显著（P＜0.01），这些差异可能因为供试刺黑竹鲜叶的叶龄1～2年大于供试八月竹鲜叶叶龄2个月～1年所致。尽管2种供试竹子鲜叶的部分指标之间存在明显差异，但圈养大熊猫和小熊猫均在嗅闻这2种竹子鲜叶的气味后取食，说明圈养大熊猫和小熊猫对竹子鲜叶的一些气味指标都有一定范围的包容性。当鲜叶变干至叶片卷曲并变色时，不再被圈养大熊猫和小熊猫所取食，因为竹叶变干的过程既是一个失水的过程，也是一些优势气味韵调散失的过程[7]。结合对斑苦竹鲜叶的气味品评得分结果[7]，圈养大熊猫和小熊猫摄食新鲜竹叶的主要气味指标适宜范围如下：气味强度7.80～8.60，气味愉悦度7.05～8.60，气 味 透 发 性6.90～8.40，青 香7.50～8.10，甜气4.30～5.40，木香（木质气）2.20～4.00，新鲜 感6.40～8.20，多 汁 感4.85～6.60，嫩 感3.20～6.00。这些气味指标的组合构成了新鲜竹叶对圈养大熊猫和小熊猫的诱食性。

3.3 圈养大熊猫和小熊猫喜好的竹叶香气韵调特点

对圈养大熊猫和小熊猫摄食竹叶行为的观察结果表明，圈养大熊猫和小熊猫与刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶之间的关联是通过这2种鲜叶自身散发出的气味来传递有效信息才得以实现，这是长期自然选择和协同进化的结果。竹叶的气味可向圈养大熊猫和小熊猫传递安全性、可食性、营养性等有效信息，被圈养大熊猫和小熊猫嗅觉感知并获得认同后才可能继发取食竹叶的行为。圈养大熊猫和小熊猫所食的刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶气味强度较大，利于他们嗅感，愉悦度较高可能预示鲜叶的安全性较高，透发性较强说明鲜叶气味的扩散性较好，显著的青香和新鲜感、明显的多汁感、轻微的甜气、微微的木香以及不同程度的嫩感可能构成鲜叶的可食性，并表征鲜叶的营养性，这些香气韵调组合在一起形成了刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶特有的优势香气韵调。结合此前对圈养大熊猫幼仔喜食的母乳[8]、2种补饲奶粉[11]、亚成体和成体所食的特制窝窝头[12]、新鲜玉米秸秆[5]、新鲜苹果和胡萝卜[13]、6种新鲜竹秆[22]和竹叶[6-7]、2种新鲜竹笋[14]以及不食的阴干斑苦竹叶的气味特点研究结果[7-14]，认为圈养大熊猫和小熊猫喜欢刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶的香气韵调有青香、甜气、新鲜感。显著的青香和新鲜感、轻微的甜气等是诱导圈养大熊猫和小熊猫取食刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶的主要香气韵调。

3.4 应用建议

目前，我国尚无人工饲养大熊猫和小熊猫的食物添加剂要求或标准。若要研制大熊猫和小熊猫的竹叶诱食剂，所用原料应遵循“从食物中来，到食物中去”的安全原则。从刺黑竹鲜叶中发现的2-戊酮、d-柠檬烯、α-松油醇、十四酸和从八月竹鲜叶中发现的2-庚醇、反式-2-丁烯酸叶醇酯、反式，顺式-3,6-壬二烯-1-醇、十四酸是圈养大熊猫所食其他6种竹叶中未曾被测出的单体呈香物质[6-7]，扩大了竹叶诱食剂的可选单体香料范围。研制竹叶诱食剂时，可参照刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶的整体气味指标（见图1）、主要香气指标（见图2）和主要韵调指标（见图3），酌情酌量选用表1中带☆号和文献[6-7]已报道的典型香气成分单体物质，模拟新鲜竹叶的气味特点进行调配香精，方可具有良好的诱食效果。

4 结 论

本研究表明，圈养大熊猫和小熊猫所食刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶的共同气味韵调特点为：气味较浓，愉悦度较高，透发性较强，青香显著，均有轻微的甜气和微微的木香，显著的新鲜感，明显的多汁感和不同程度的嫩感。从刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶中分别发现了44种和45种典型香气成分，醛类和醇类典型香气成分是刺黑竹鲜叶和八月竹鲜叶气味的主要贡献物质种类。这有助于探究圈养大熊猫和小熊猫摄食的气味机理和研发其竹叶诱食剂。

致谢：本研究的气味品评在成都大帝汉克生物科技有限公司/四川省动物采食调控工程技术研究中心进行，喻麟董事长和李小兵总经理给予了支持，李松柏高级工程师、邓虹高级工程师、黄明亚工程师以及西华大学食品与生物工程学院的包清彬教授参加了气味品评，吴劲旭老师核定了供试竹种的学名，卧龙神树坪基地的曾文等同仁，都江堰基地的瞿桂英、廖友平等同仁在圈养大熊猫和小熊猫的饲喂试验与竹叶采样时积极配合，中国科学院成都分院分析测试中心的胡静副研究员在挥发性成分分析与推定方面提供了帮助，在此一并深表谢意！