共聚焦显微拉曼光谱鼻咽癌检测中的研究进展*

王 雪，王萌萌，张秀明 综述,熊 丹，3△ 审校

1.深圳罗湖区人民医院医学检验科，广东深圳518000；2.汕头大学医学院，广东汕头 515041； 3.上海市公共卫生临床中心，上海201500

鼻咽癌(NPC)是起源于鼻咽上皮的头颈部恶性肿瘤，据2018年发布的最新数据显示，全球NPC新发病例约 12.9 万例，其中中国的新发病例占全球的一半以上，该病对华南等NPC高发地区人民的生命健康造成严重威胁[1]。早期NPC对放疗非常敏感，早期患者经放疗及临床综合治疗，5 年生存率可高达 95%。但NPC发病部位隐匿，大部分NPC患者确诊时已处于中晚期，这是导致NPC患者生存率普遍偏低的主要原因[2]。我国作为NPC发病率最高的国家，提高NPC早期诊断、疗效和预后评价体系对改善我国NPC防治效果有重要意义。目前，NPC的临床检测手段主要包括：(1)EB病毒(EBV)病原体检测，包括EBV-DNA和EBV编码的微小RNA(miRNA)及EBV血清学抗体检测，是目前临床使用的最广泛的生物标志物，但仅针对非角化型NPC患者，且灵敏度和特异度均不理想。(2)影像学检测，包括CT、MRI、PET/CT等，在晚期NPC预后判断中具有良好的效果，但影像改变往往滞后于疾病进展。(3)鼻腔镜活检结合病理组织分期是目前诊断NPC的金标准，但是病理学检查具有侵袭性，检测依赖于病理医师的经验判断，具有一定的主观性，难以对早期肿瘤或微小病灶进行准确诊断。以上手段在NPC的早期诊断上均存在一定的局限性。

拉曼光谱是由印度物理学家拉曼(Raman)于1928年发现的一种散射光谱，拉曼光谱技术可对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息[3]。该技术能够用于分析物质分子化学成分、结构等信息，且操作简便，无创，水干扰小和分辨能力高，在生物医学等多个领域具有明显的优势和广泛的应用。传统的拉曼光谱以单点探测为主，对于复杂的生物组织结构分析具有一定的局限性，难以获得完整的组化信息。随着当代技术的发展，新的拉曼光谱分析方法不断产生，诸如表面增强拉曼光谱、共振拉曼光谱、相干反斯托克斯拉曼光谱法、受激拉曼散射、空间位移拉曼光谱和共聚焦等拉曼光谱。上述诸多新兴的拉曼光谱分析方法可对生物样本实现定性、定量、定位的研究，近年来已被广泛应用于人体细胞组织、人体体液和生物标志的检测，其在肿瘤早期诊断和预后监测也有巨大的潜能。例如，表面增强拉曼光谱可识别多种癌症，包括乳腺癌[4-5]、卵巢癌[6]、皮肤癌[7-8]、前列腺癌[9-10]等，其在化疗药物监测方面也有初步应用[11]。表面增强拉曼光谱同样应用于NPC诊疗过程中，如组织的良恶性、NPC分期等[12]。NPC患者体液样品分析[13]以及内镜检查方面的开发[14]也被广泛研究，该技术能够检测NPC癌前病变状态下细胞、组织以及体液的相关分子改变。但是表面增强拉曼光谱存在操作复杂、重现性较差等弊端，限制了其在临床上广泛使用的进程。共聚焦显微拉曼光谱技术是将拉曼光谱技术与共聚焦显微分析技术结合起来的一种光谱分析技术，不依赖于表面增强，能够在无标记、无增强的条件下，对NPC细胞、组织、体液等进行检测，在NPC早期诊断方面具有极大应用潜力。据此，本文综述了近几年来共聚焦显微拉曼光谱在NPC诊断中的研究进展和应用前景，旨在为共聚焦拉曼光谱在NPC临床诊断应用的发展提供参考。

1 共聚焦显微拉曼光谱原理

共聚焦显微拉曼光谱技术是将拉曼光谱技术与共聚焦显微分析技术结合起来的显微共聚焦拉曼光谱成像技术(CRMI)，采用了低功率激光器、高转换效率的全息电荷耦合阵列检测器，共聚焦显微镜将激发光的光斑聚焦到微米量级,进而在不受周围物质的干扰下对样品的微区进行精确激光照射分析,产生的拉曼散射可通过光谱仪的解析而获得照射区域物质的拉曼图谱[15]。相较于传统拉曼光谱，共聚焦显微拉曼光谱具有更高的空间分辨率、工作频率、运行速度和灵敏度等，其不但能对规模小至 0.5～1.0 μm微量样品进行分析，而且能够实现光谱与三维图像相结合的定性、定量与定位分析。由于待测样本体积微小，检测结果几乎不受荧光干扰，因而适合临床检测及化学结构分析[16]。目前，共聚焦显微拉曼光谱在多领域均有应用，如鉴定和区分细菌菌株[17]，在亚细胞水平上分析化学组成[18]。国内外已有一些共聚焦显微拉曼光谱在肿瘤检测中应用的报道[19-20]。在NPC相关研究中，共聚焦显微拉曼光谱不仅能够对NPC单细胞进行检测，同时也能区分NPC和正常组织的化学组成及分子结构，实现对NPC的快速诊断。 除此之外，共聚焦显微拉曼光谱还能监测化疗药物浓度及预测细胞耐药性。总而言之，早期诊断及精准治疗能够明显改善患者预后及提高生存期，这对NPC的防治具有重要意义。

2 共聚焦显微拉曼光谱在NPC检测中的应用现状

2.1共聚焦显微拉曼光谱在NPC单细胞检测中的应用 广泛应用的细胞内成像方法有电子显微镜、冷冻电镜术和免疫荧光显微镜等，这些方法由于需要固定、冷冻或荧光标记的特点，均有侵入性，对被测细胞具有破坏性。1990年，PUPPELS等[21]首次应用共聚焦显微拉曼光谱技术对单细胞内的分子构成进行了研究，自此，该技术因其高灵敏度，抗水干扰性及非标记、非侵入性被广泛应用于组织鉴别和单细胞生物学的相关研究中。由于共聚焦拉曼光谱在分选癌细胞和正常细胞中具有高度特异度，其有望成为广泛应用的无标记细胞分选新技术。早期研究已成功将共聚焦拉曼光谱用于区分不同肿瘤的正常和恶性细胞系中，如皮肤癌[22]、黑色素瘤[23]、前列腺癌[24]、胶质瘤[25]。YE等[26]采用共聚焦拉曼光谱发现NPC细胞和鼻炎上皮细胞在1 449、1 657 cm-1光谱区域存在差异，进而成功区分NPC和正常细胞系，并对不同的NPC细胞系(C666和CNE2)进行区分，特异度高达100%。LI等[27]应用显微拉曼光谱成功区分了3种不同的NPC细胞和正常细胞系(C666-1、CNE1、CNE2和NP69)，灵敏度和特异度均高于90%。这些研究结果表明共聚焦拉曼光谱具有分选肿瘤细胞和正常细胞的潜能，有望成为一种无标记肿瘤细胞分选方法并区分不同类型的肿瘤细胞，为NPC的诊断治疗提供参考。

2.2共聚焦显微拉曼光谱在NPC患者体液中的研究 人体体液(血清、血浆、全血、唾液、尿液等)含有无机盐、糖、维生素、核酸、蛋白质、脂类等各种成分，这些分子的构象、组成和肿瘤的发生发展以及药物的疗效密切相关。共聚焦拉曼光谱可以通过监测体液中分子变化从而实现肿瘤的诊断、治疗效果以及预后评估。栾艺等[28]早期采用共聚焦拉曼检测系统对胃癌患者和非胃癌患者血清检测时发现，在1 003、1 155、1 446、1 517、1 655、2 873、2 932、3 059 cm-1位移处的8个峰值存在差异，通过合OPLS-DA的统计分析发现共聚焦拉曼光谱技术可对胃癌、胃良性病变患者及健康者的血清做鉴别区分。潘建基等[29]采用共聚焦显微拉曼光谱对NPC患者和健康者血清进行检测，发现在900～1 000 cm-1、1 600～1 700 cm-1和1 200～1 400 cm-1波段，NPC患者和健康者血清谱峰存在明显差异，诊断特异度达91.7%。以上研究表明，共聚焦拉曼光谱可通过体液区分NPC患者和健康人群，其有望成为NPC无创辅助诊断的新方法。

2.3共聚焦显微拉曼光谱在NPC患者组织中的应用研究 恶性肿瘤组织和正常组织的蛋白质、核酸、脂肪等组成及结构不同，共聚焦显微拉曼光谱能从分子水平上反映组织化学组成和分子结构上的差异。有研究报道显示，共聚焦显微拉曼光谱可通过从分子结构区分不同的肿瘤病理组织类型，例如HSU等[30]通过共聚拉曼光谱与PCA-LAD结合区分胃腺癌的病理分型，如乳头状腺癌(PAC)、管状腺癌(TAC)、黏液腺癌(MAC)和印戒细胞癌(SRC)。此外，整个监测过程只需几分钟且无需免疫组化等组织预处理。LI等[31]将共聚焦显微拉曼光谱与GA-LDA算法结合，通过792～805,867～880,996～1 009,1 086～1 099,1 288～1 304,1 663～1 670,和1 742～1 752 cm-1区域的光谱差异成功区分NPC组织和正常组织，特异度达100.0%。SUN等[32]使用共聚焦显微拉曼光谱对NPC组织涂片进行检测，结合多变量统计分析可对NPC和正常组织涂片进行区分，诊断灵敏度和特异度分别为87.2%和85.7%。以上研究表明，共聚焦显微拉曼光谱能够快速准确地探测组织化学组成和分子结构，从而区分肿瘤组织与正常组织，这一优点也有助于手术时区分良恶性组织的边界以确保肿瘤组织的完整切除[33]。

2.4共聚焦显微拉曼光谱在NPC治疗药物监测中的应用 由于共聚焦显微拉曼光谱能对单个活细胞的化学成分进行特异度分析且无需标记，不受荧光干扰，因此其不仅能对细胞内存在的药物进行检测，也能监测药物的疗效，这将促进体内外细胞与药物相互作用的相关研究[34]。近年来共聚焦显微拉曼光谱已经被广泛用于研究化疗药物对真核细胞的影响[35]。HUANG等[36]通过共聚焦显微拉曼光谱技术采集不同浓度顺铂处理后的NPC细胞指纹图谱时发现，顺铂对NPC细胞基因组有降解作用。顺铂对癌细胞的作用机制也在肺腺癌中得到验证。NAWAZ等[37]使用共聚焦显微拉曼光谱技术测定肺腺癌细胞对顺铂的反应，并研究了96 h内不同药物浓度的疗效。许元基[38]用共聚焦拉曼光谱对NPCCNE-2细胞系进行了尼妥珠单抗增敏研究，发现随着药物浓度的增高，尼妥珠单抗的放射增敏作用越强。此外，有研究表明共聚焦显微拉曼光谱可以检测化疗药物在亚细胞内的转运和积累途径，并预先识别耐药肿瘤细胞，从而优化化疗疗效[39]。以上研究结果表明，共聚焦显微拉曼光谱能够定量分析体内外细胞药物的浓度，监测细胞活力，在分子水平观测抗肿瘤药物对NPC细胞的疗效，为临床NPC化疗药物的个性化选择提供参考。

3 共聚焦显微拉曼光谱在NPC转移代谢监测中的应用前景

共聚焦显微拉曼光谱不仅在肿瘤诊断治疗方面具有很大的优势，它在肿瘤转移监测方面同样具有很大的前景。共聚焦拉曼光谱能够在单个细胞水平上成像细胞结构并且能定量特定生物分子以此监测肿瘤的代谢过程。有文献报道[23]通过共聚焦显微拉曼光谱对两性细胞膜穿透肽(CPPs)转运蛋白(Tp)在转移性黑色素瘤细胞系SK-Mel-2中的浸润和生理效应的研究中发现，细胞硬度的增加是由Tp诱导细胞骨架改变引起的[23]。CHRISTINA等[40]利用共聚焦显微拉曼光谱识别并量化了乳腺癌细胞中脂肪组织介导的脂滴形成和生化改变。PACIA等[41]研究表明，利用拉曼三维共聚焦成像结合AFM内皮表面成像分析血管壁各层，证明肿瘤转移诱导的全身内皮功能障碍导致主动脉内皮发生明显的化学变化，如蛋白质含量显著增加(18.0%)和脂质含量轻微降低(4.0%)，这些变化仅限于内皮细胞，不发生在血管壁深层[41]。此外共聚焦显微拉曼光谱还可以通过监测循环肿瘤干细胞(CCSC)、循环肿瘤细胞(CTC)等在单细胞水平上快速获取细胞分子表型的重要信息，有助于揭示细胞和组织的代谢病理等机制与过程，预测肿瘤转移和复发[42]。以上研究表明共聚焦显微拉曼光谱可用于识别生物样本中的代谢变化，从而为包括NPC在内的相关肿瘤的发病机制研究提供参考。

4 结 论

在过去的几年中，大量的研究工作表明共聚焦显微拉曼光谱作为一种新技术得到了越来越多的认可。与传统拉曼光谱技术相比，共聚焦拉曼光谱有信号强、灵敏度高、测量时间短、所需样本量小等优点，该技术能够实现在细胞、组织、体液等不同类型的样本中的检测及对体内外药物浓度及作用机制进行实时监测，因此在肿瘤的早期诊断及预后研究中具有良好的发展前景[43]。NPC由于其发病隐匿，临床症状及影像学表现往往滞后于疾病进展，早期诊断十分困难。共聚焦显微拉曼光谱技术无需外源染色和标记，仅通过检测单个NPC活细胞内化学成分结构差异指纹图谱即可获得分子特异性信息，达到快速、无创的诊断。该技术不但可以辅助手术中癌组织的切除，而且能在免受荧光和抗体污染的情况下分选NPC细胞。此外，共聚焦拉曼光谱能对NPC药物治疗进行监测，且在NPC转移代谢中有很大的应用前景。

共聚焦显微拉曼光谱虽然在基础研究领域有广泛应用，但在临床应用方面缺少相关经验。共聚焦显微拉曼光谱虽能对单细胞进行三维成像，但一次仅能检测一个细胞，难以对大量的细胞进行高通量检测，故需结合其他已建立的显微成像技术，如荧光和电子显微镜等。共聚焦显微拉曼光谱与其他技术相结合能够更广泛地了解相关标本特征，评估待测组织或细胞系的细胞分布，结合统计方法，设定获得有意义结果所需测量的检测限。正常组织和癌症组织的拉曼光谱模式有时可能非常相似，因此，可开发自动化的样品捕获和有效的诊断算法来解释微小的光谱变化，此外，确立可靠的细胞组成分布的检测标准也是共聚焦拉曼技术普及应用的重要前提。最后，共聚焦拉曼光谱用于体内诊断时，也需要考虑组织热损伤问题。综上所述，随着共聚焦拉曼光谱技术的不断完善和互补技术的建立，它在NPC早期诊断、预后、治疗转移监测等临床诊疗领域将会有光明的前景。