高通量测序用于结核病诊断的研究进展

王 玺 综述，兰 箭 审校

重庆医科大学附属第二医院呼吸与危重症医学科，重庆 400000

结核病是结核分枝杆菌感染所致的疾病，人型结核菌为人类主要致病型。结核分枝杆菌可以感染机体除毛发、指甲以外的任何部位，其中以肺部感染最常见。结核病位列全球第13大死因，据《2021全球结核病报告》显示，2020年全球结核潜伏感染人群接近20亿，新发患者987万，发病率为127/10万；我国估算的新发患者数为84.2万，发病率为59/10万，在30个结核病高负担国家中我国高居第2位，仅次于印度[1]。目前结核病的辅助诊断方法很多，涉及病原学、影像学、分子生物学、免疫学以及病理学等，但诊断效能欠佳。结核菌培养是确诊结核病的金标准，但灵敏度仅为45%～60%[2-4]，临床诊断往往需要联合多种方法进行检测分析，并常常采取诊断性抗生素治疗方式来辅助临床判断，导致结核病诊断的延误和治疗的延后，因此提高检测方法的灵敏度和特异度对结核病的防控意义重大。NGS采用基因测序方法能快速检出病原微生物，本文就NGS应用于结核病诊断的研究进展进行综述。

1 NGS概述

基因组测序共经历了三代技术发展。一代测序的优点是准确度高、容易掌握，缺点是耗时长、过程复杂、费用高。二代测序，也就是NGS，它以循环微阵列法为原理，包括样本处理、核酸提取、基因文库生成和生物信息学途径分析几个步骤[5]。NGS一次能对高达几百万条的DNA分子测序，使物种的基因组或转录组测序变得容易。NGS用于病原学的检测包括靶向下一代测序(tNGS)、宏基因组下一代测序(mNGS)、全基因组测序(WGS)等。tNGS是对富集后的目的DNA序列进行高通量测序，只能用于核酸序列已知的病原体的检测；mNGS是直接提取样本中全部微生物群落基因的DNA进行测序，理论上一次性可以检出全部的微生物序列；WGS是对整个基因组进行检测，可以检测编码区、非编码区、调控区，以及一些结构变异。相对于一代测序，NGS的准确性略有降低，但通量高、耗时短、成本低，更适用于临床使用。三代测序是以单分子测序技术为基础的新一代测序方式，不需要经过PCR扩增，主要分为单分子荧光测序技术和纳米孔测序技术，近年来三代测序逐渐控制了成本，但在精度上仍需进行更多的研究与验证[6-7]，目前较少应用于临床。

NGS包括DNA测序和RNA测序，DNA测序可检测除RNA病毒以外的病原微生物，RNA测序可检测RNA病毒，同时还可以反映病原微生物转录活性[8]。mNGS可以检测来自人类、动物、食品和环境的各种标本，在不预先了解病原体类型的情况下能直接检出所有微生物序列，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。由于不同病原微生物有不一样的生长条件，常规的标准培养往往不能培养出标本中的所有病原微生物，所以NGS将来有可能成为微生物实验室的主导技术[9-10]。NGS还能对艾滋病、结核病、流感、脊髓灰质炎、疟疾等传染性疾病进行监测[11-12]。多项研究指出，在感染性疾病中mNGS的灵敏度高于传统培养法[13-14]，尤其是用于血液、支气管肺泡灌洗液和痰液标本的检测[15]。在肺部感染性疾病的病原学检测中，NGS比传统方法检测范围更广、检出率更高、耗时更短，且能明显提高了真菌感染的诊断率[16-18]。相较于普通病原菌，结核分枝杆菌更难培养，因此NGS用于检测结核分枝杆菌的检测是极具前景的。

2 常用的结核病检测方法

目前关于结核病的检测方法很多，包括涂片法、培养法、病理活检、影像学检查以及结核分枝杆菌核酸检测、纯化蛋白衍生物(PPD)试验、γ干扰素释放试验(IGRA)、结核抗体检测等，确诊结核病常常需要上述检测方法的联合使用[19]。

涂片法的依据是结核分枝杆菌的抗酸特性，是指将样本进行涂片、染色，根据染色情况判定结果。该法简便、快捷，但灵敏度受样本质量的影响大，且不能鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌[20]。培养法特异度高，但由于结核分枝杆菌生长缓慢，不管是罗氏固体培养基(2～4周)还是改良液体培养基(1～2周)，都无法避免培养周期长的问题，不能快速得到结果[19]。阳性培养标本还需要进一步进行耐药表型分析，即结核分枝杆菌药敏试验(DST)，以了解结核分枝杆菌是否存在耐药，但需耗时2～4周。在结核病高负担国家，培养法的低效能限制了其在早期诊断中的临床应用[12]。病理活检也是诊断结核病的方法之一，结核病的病理改变表现为上皮细胞样肉芽肿性炎，光学显微镜下可见大小不等、数量不同的坏死性和非坏死性的肉芽肿，同时需要在病变区找到病原菌，并采用抗酸染色方法来确定[19]。但部分患者活检难度大，且增加了诊治风险，从而限制了临床上的广泛开展。胸部X片是临床筛查肺结核的最常用方法，但容易漏检，相比之下，胸部CT可以发现更小、更隐匿的病灶。肺结核病灶具有多形性的特点，容易出现空洞、硬结及钙化灶，常位于上叶尖后段及下叶背段，但影像学不典型者也并非罕见，常常需要与其他病原菌感染相鉴别，因此影像学检查只能作为诊断结核的辅助证据。

核酸检测技术的发展在一定程度上弥补了传统病原学检查的局限性，灵敏度和特异度均有所提高。常用方法包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增反应(LAMP)、利福平耐药快速检测(Xpert MTB/RIF)等。LAMP无法对检测结果进行耐药性判断[21]，而Xpert MTB/RIF可同时用于结核病的诊断和耐利福平结核菌的判断[1]。LAMP与Xpert MTB/RIF在结核病的诊断中有较好的一致性，明显优于涂片法[22-23]；在临床诊断患者中，两者灵敏度与培养法接近，特异度高于培养法；但在有抗结核活性药物暴露史的患者中，两者灵敏度优于培养法[22]。抗结核药物通过抑制细胞壁、蛋白质、酶的合成等原理降低结核分枝杆菌菌株活性[24-27]，而核酸可以较长时间保留在死亡菌株中，同时也说明分子生物学方法不能替代结核菌培养用于药物疗效监测。由于LAMP操作简单、成本低，当Xpert MTB/RIF由于条件限制不能开展时，LAMP可以取代涂片显微镜检查，提高结核病诊断能力[22]。此外，核酸检测技术还应用于耐药结核的基因型分析，包括基于反向杂交的线探针分析(LPA)和半定量Xpert MTB/RIF[28]，但临床上的应用不如表型分析广泛。

结核分枝杆菌感染人体后会发生一系列免疫反应，基于此的检验方法有PPD试验和IGRA。PPD试验是基于Ⅳ型超敏反应的皮肤试验，根据硬结及水泡的情况在试验后72 h判定结果，该法干扰因素较多，有出现假阳性或假阴性可能，且不能区分活动性感染与潜伏感染，灵敏度较低。IGRA包括结核菌感染T细胞斑点试验(T-SPOT)和酶联免疫吸附测定(ELISA)，它们都有很高的灵敏度，且T-SPOT法特异度稍高于ELISA法，且同样不能区分活动性感染与潜伏感染[29]。血清结核分枝杆菌抗体在体内存在时间很长，即使结核病痊愈后仍可以检测到，尽管检测敏感度在70%左右，但并不能作为判断结核病活动性的指标[30]。

3 NGS在结核病诊断中的应用

3.1NGS检测结核分枝杆菌 多项研究报道，NGS检测结核分枝杆菌的特异度高达98%以上，而灵敏度明显优于传统培养法和Xpert MTB/RIF[31-33]。NGS在不同部位来源的样本检测中也存在差异，肺样本的检测灵敏度明显高于肺外样本，分别为58.5%和43.1%；痰液检测灵敏度为52.3%，略低于培养法的60.9%；但在培养阴性的支气管肺泡灌洗液和浆膜腔液体样本中，NGS阳性检出率仍有28.8%，提示NGS有利于菌阴结核病的诊断[32]，且NGS对肺外结核的诊断效率仍高于传统培养法和Xpert MTB/RIF[32-36]。NGS检测需要32～36小时，液体培养基培养法需要14～55天，虽然涂片法只需1～2天，但它的灵敏度及特异度均不如NGS，因此NGS有利于活动性肺结核的早期诊断[32]。

WGS通过检测单核苷酸多态性(SNP)的多寡，可以用来评估和鉴别结核病患者是否合并感染、复发或者再感染。如果变量位置显示具有不同等位基因的群体共存，则可以在大量测序数据中检测到合并感染[37-38]。对复发结核患者前后两次的标本进行检测，也可判断是复发还是再次感染。一项摩尔多瓦的研究对患者进行基因测序显示，在多个耐药结核样本之间的SNP差异不超过10个，从基因层面证实了人与人之间的传播[39]。痰液和支气管肺泡灌洗液都可以作为NGS检测的样本，但痰液更容易被污染，在变异分析中会引入更大的偏差，出现不真实的SNP。对于痰稀少的疑似肺结核病例，支气管肺泡灌洗液或肺组织是更好的结核分枝杆菌检测标本，但这类标本都包含大量的人类基因，需进行严格的质量控制以减少宿主基因组的影响[40]。由于部分标本的黏液含量高，结核分枝杆菌可能发生聚集而分布不均，导致结核菌计数不准确，因此样本需要预处理，通过耗尽其他细胞DNA来均化和富集结核杆菌，以提高NGS诊断率[41]。除此之外，抗结核治疗会显著降低NGS的检出率，这提示NGS样本需要在经验性治疗前收集，并且样本如果在检测或运输过程中被污染同样会降低NGS诊断率[33-34]。另外，由于结核分枝杆菌是胞内菌，体液中的病原体含量较少，在检测过程中需对细胞进行破壁处理，这可能会破坏遗传物质，导致检出率降低。

3.2NGS对耐药结核菌的识别 结核病疫情难控制的原因和耐药菌株的增加密切相关，耐药结核患者数量增加的主要原因是不适当的治疗和耐药结核分枝杆菌分离株的社区传播。在基因组水平上，结核分枝杆菌的耐药性是由单个或多个结核分枝杆菌基因的遗传变异造成的。NGS用于鉴别结核分枝杆菌分离株的分子分型技术，有基于IS6110的限制性片段长度多态性分析(IS6110-RFLP)、分枝杆菌散布重复单位-可变数目串联重复序列测定(MIRU-VNTR)、WGS等。IS6110-RFLP分型在20世纪90年代是公认的结核病基因分型的金标准[42]，但它费力耗时，对操作人员要求高，而且对IS6110拷贝数在5个或以下的菌株没有足够的分辨能力[43]。2009年欧洲疾病预防和控制中心(ECDC)提出将MIRU-VNTR作为结核病基因分型的金标准。MIRU-VNTR分型结果格式简单，以DNA扩增为基础，不需要对结核分枝杆菌进行培养，并缩短了实验室检测时间[44]。2019年，ECDC提议在一些优先病原体的监测和暴发调查中使用WGS。一项评估WGS在实验室诊断分枝杆菌性能的研究显示，93%的分枝杆菌与常规实验室鉴定结果一致，93%的结核分枝杆菌复合群药敏预测与DST结果相符合[45]。WGS用于分子分型可获得高分辨能力的精确遗传信息，但目前微生物数据库尚缺乏广度和精度，且没有统一的解读标准，因此普及推广面临着挑战[43,46]。

由于结核病耐药是由结核分枝杆菌基因突变引起的，因此使用NGS进行耐药监测有很大优势。NGS的成本与DST相当，且耗时短，它可以识别所有可能导致耐药的突变，不管是已知的还是未知的，同时还可以区分改变表型的耐药突变和不改变表型的沉默突变[28,41,47]。在利福平耐药的检测上，Xpert MTB/RIF检测耐利福平结核菌的特异度(99.5%)比NGS高，但灵敏度较低(61.8%)[34]。一项研究采用NGS检测了1000多份痰菌阳性样本，发现结核病患者对利福平、氟喹诺酮、吡嗪酰胺的耐药率低，但对利福平敏感患者对异烟肼的耐药率较高。如果使用Xpert MTB/RIF检测利福平耐药性，将导致漏诊很多耐异烟肼结核病患者[34]。这也说明了传统的分子技术不足以评估全部的耐药突变，需要进行多重分析。NGS检测一线抗结核药物和部分二线抗结核药物耐药性的准确率很高[48]，表型结果与基因型结果的一致性较好，但由于抗药性遗传基础不完全清楚，故基因型方法还不能完全取代传统的表型方法[12,48-49]。有报道分析了88株再培养的耐多药肺结核病(MDR-TB)菌株，比较NGS和一代测序对于吡嗪酰胺耐药的突变检测，两者结果符合率为89%，NGS不仅证实了一代测序检测到的吡嗪酰胺耐药的主要突变基因，即pncA基因，还发现了几个新的混合菌株突变，解决了部分基因型与表型结果不一致的问题[50]。随着NGS更多应用于结核病的耐药性检测，以及基因序列数据信息的不断补充和完善，NGS有望用于结核病耐药的定量解释，以指导制定后续治疗方案[51]。与DST相比，WGS可以了解不同地区的结核分枝杆菌耐药模式和在传播过程中不断获得的耐药性信息，这更有利于结核病疫情的控制[52]。

4 总结和展望

我国是结核病高负担国家，由于传统检测方法的局限性，结核病的早期诊断和防控仍面临很大挑战。NGS检测特异度高，且灵敏度高于培养法和Xpert MTB/RIF，能快速检测样本中所有的微生物序列，在结核病的早期诊断和鉴别诊断上有很大的价值。NGS可以对多种样本进行检测，对肺结核和肺外结核的诊断都有很大帮助；同时还能鉴别结核患者是合并感染、复发或者再感染；能识别所有可能导致耐药的突变，确定耐药菌株的传播模式，有利于阻断结核病的传播。

目前NGS缺乏全面且高精度的数据库，对检测出的基因阈值不能进行量化分级，对检测结果没有统一的解读标准，对操作没有统一的流程，这些都是NGS广泛推行面临的问题。虽然NGS在结核菌感染中的研究日益增多，但高中低风险区都缺乏多中心和大规模的前瞻性研究，使其诊断效能和可信度都大打折扣。NGS是医学、分子生物学、生物信息学等多学科发展进步的成果，目前用于结核病的早期诊断和耐药结核的鉴定还欠成熟，其发展和完善还需要多学科的共同努力和协作。