外泌体在急性肺损伤中的作用研究进展

张涛,岳渊,肖漓

1.佳木斯大学基础医学院,佳木斯 154007;2.中国人民解放军总医院第八医学中心呼吸与危重症医学部研究所,北京市器官移植与免疫调节重点实验室

急性肺损伤(ALI)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭,是呼吸科常见的危重疾病之一[1]。据报道,ALI患者的病死率达35%～40%[2]。其临床症状为发热、咳嗽、痰中带血,部分患者可伴有呼吸困难或胸痛,ALI发展至严重阶段被称为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[3]。导致ALI患者的原因有很多,如感染、休克、严重非胸部创伤、重度烧伤、大量输血、急性胰腺炎及药物中毒,或吸入烟尘、氧中毒及放射性损伤等[4]。由于ALI患者病死率居高不下,故早期快速诊断以及探索有效的治疗方法意义重大。

近年来,越来越多的研究证明间充质干细胞(MSC)及其分泌的外泌体可以治疗ALI,MSC可以分泌多种细胞因子,MSC来源的外泌体(MSC-exo)则可以通过所携带的miRNA和蛋白质作用于靶细胞,通过不同的机制来干预和调控ALI的发展[5-6]。MSC释放的外泌体不仅有类似于干细胞的趋化作用,而且其免疫原性较弱,具有非常好的发展前景[7]。最近的研究发现其他细胞如肺泡上皮细胞、内皮祖细胞等分泌的外泌体也对ALI的修复发挥一定作用。

1 外泌体的概念与生物学特性

外泌体是直径30～100 nm的囊泡样小体,属于一种细胞外囊泡(EV),由多种细胞主动向胞外分泌,包含复杂RNA和蛋白质。其首次发现于20世纪80年代,Trams等[8]观察到网织红细胞在成熟期间会分泌一种含有转铁蛋白受体的小囊泡,介导转铁蛋白受体的清除。在此后的十余年间,外泌体仅被看作是细胞清除代谢废物的工具[9]。直到20世纪90年代末,Zitvogel等[10]研究表明,外泌体可能是细胞间通讯的重要媒介,这才重新激起了人们对外泌体研究的兴趣。人体中几乎所有类型的细胞都能产生外泌体,它可以从多种体液中被分离出来,包括血液、尿液、肺泡灌洗液(BALF)、唾液和脑脊液等。外泌体通过内体和质膜2种途径产生,其中研究最多的是内体途径(即先由质膜出芽形成早期内体,然后早期内体萌发腔内囊泡形成囊泡小体,最终囊泡小体与质膜融合释放外泌体),也可以从质膜直接出芽形成(即质膜途径)。

外泌体参与多种生理和病理过程,具有促凝和抗凝作用、促炎和抗炎作用、促血管生成等多种生物学活性。外泌体具有以下特点:①结构特殊,特性稳定,可以长时间低温保存且不改变其活性;②体积小,可避免微循环阻塞;③外泌体表面有磷脂膜,可保证多种生物活性成分不易被酶降解。相比于细胞,外泌体在治疗方面更具优势和应用潜力。因此,外泌体的研究在医学领域日益受到瞩目。

目前研究证实,外泌体是细胞间的通讯方式之一,可以完成细胞间遗传物质、脂质和蛋白质的交换[11]。外泌体通过不同的途径将信息传递给靶细胞,主要包括:①外泌体膜上的蛋白直接与靶细胞膜上的蛋白接触,触发胞内信号级联;②外泌体胞膜与靶细胞胞膜融合,释放其内容物进入靶细胞;③靶细胞直接吞噬外泌体并将其内化为组成部分。

2 外泌体的生物学功能

细胞凋亡的调控异常会导致多种疾病,ALI是由于细胞凋亡和肺部炎症反应过度而导致组织损伤加重。其中脂多糖(LPS)诱导肺损伤后的细胞凋亡是导致ALI的主要途径之一。Liu等[1]研究表明,骨髓间充质干细胞(BMSC)来源的外泌体(BMSC-exo)可有效抑制LPS诱导肺损伤后肺泡巨噬细胞(AMs)中的自噬体和自溶酶体斑点的形成,进而阻止LPS诱导的AMs凋亡。Mao等[12]研究表明,BMSC-exo在硫芥(SM)导致的ALI中具有抗细胞凋亡的作用。SM是一种可导致ALI的剧毒化学试剂。结果显示,注射BMSC-exo 24 h后,凋亡细胞数量显著减少。

外泌体不仅可以抑制细胞凋亡,同时具有促炎或抗炎作用。ALI时出现肺内炎症反应不可控,大量炎症细胞和炎症因子释放。AMs是驻留在肺组织中的主要免疫细胞,它通过释放过量的炎症细胞因子,促进中性粒细胞浸润和肺组织损伤,这在ALI发病机制中起核心作用。肺泡上皮细胞(AEC)是一种具有较大表面积的肺部结构细胞,在肺损伤过程中AEC通常最先被破坏。而外泌体在AMs和AEC之间的信息传递中发挥重要作用。Sui等[13]研究表明,巨噬细胞培养液用LPS处理后,分离纯化出外泌体,检测到外泌体中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6的水平显著升高,说明用LPS诱导巨噬细胞后,该细胞分泌的外泌体具有促炎作用。Liu等[14]研究证实,AECs来源的外泌体(AECs-exo)可能是造成脓毒症急性肺损伤炎症加重的原因之一。实验发现AECs分泌的外泌体中的miRNAs可以将炎症信号传递给活化的巨噬细胞,进而引发肺内炎症,这表明AEC-exo在脓毒症急性肺损伤中具有促炎作用。

Li等[15]使用LPS和MSC-exo处理Ⅱ型肺泡上皮细胞(MLE-12),观察炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-10)的表达。结果显示,与LPS处理组相比,经MSC-exo处理的细胞中炎症因子表达显著下调,提示MSC-exo具有抗炎作用。Liu等[1]的实验发现LPS刺激后的血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高,随后在静脉或气管内注射BMSC-exo,TNF-α、IL-1β和IL-6的水平可显著受到抑制。上述表明BMSC-exo可以有效减轻LPS引起的炎症反应。

3 外泌体治疗ALI可能的作用机制

3.1 外泌体通过调控信号传导通路发挥作用 PI3K/Akt信号通路调控多种生理过程,包括细胞凋亡、增殖和分化。Mizuta等[16]研究证实,在组蛋白导致的ALI中,使用脂肪间充质干细胞(ADSCs)外泌体的抑制剂GW4869后,Akt磷酸化水平下调,这说明Akt磷酸化是由ADSCs来源的外泌体(ADSCs-exo)诱导的。ADSCs-exo在上调Akt磷酸化水平的同时,也激活了PI3K/ Akt信号通路,从而减轻组蛋白导致的ALI。上述结果证明了ADSCs-exo通过PI3K/Akt信号通路减轻肺损伤程度。已知机体在受到感染后,炎症反应需要启动NF-κB信号通路。Li等[15]选取了Ho-1、GPX-1、Nrf-2、NF-κb和GR等5个与NF-κb信号通路相关的基因,探讨MSC-exo能否通过NF-κb信号通路改善LPS诱导的ALI。结果显示,输注MSC-exo后,上述5个基因的表达受到显著调控,并且炎症反应程度减轻,证明了MSC-exo可通过NF-κB信号通路改善LPS诱导的ALI。

3.2 外泌体通过miRNA发挥作用 近几年的研究表明,外泌体中的miRNA在细胞间微通讯中发挥关键作用,外泌体通过促进miRNA从一个细胞转移到靶细胞而成为细胞间通讯的重要使者[17-18]。

内皮祖细胞(EPC)可参与损伤血管的修复,减轻血管渗漏和炎症反应,并增强细菌清除[19-20]。Zhou等[21]研究指出EPC来源的外泌体(EPC-exo)在脓毒症中可以预防内皮功能障碍和肺损伤,原因之一是它们携带了miRNA-126。miRNA-126是一种重要的血管生成信号调节因子,可以维持血管内皮细胞和血管壁的完整性。实验表明EPC-exo能够将miRNA-126转移到内皮细胞中,从而降低与ARDS发展相关的基因表达。此外,静脉注射EPC-exo可减轻小鼠脓毒症急性肺损伤,其原因也是依赖于miRNA-126的存在。

Yi等[22]为了证明MSC-exo分泌miRNA-30b-3p对LPS处理的MLE-12细胞的影响,将过表达miRNA-30b-3p的MSC-exo注射入ALI小鼠中,检测MLE-12 细胞的增殖、凋亡情况。结果显示,携带miRNA-30b-3p的MSC-exo可通过促进MLE-12增殖和抑制其凋亡对LPS导致的ALI发挥治疗作用,缓解ALI小鼠肺损伤。

Xu等[23]使用光气诱导大鼠ALI后,从大鼠BALF中分离出外泌体,发现外泌体促进了MSC增殖和IL-10释放。通过miRNA谱分析,发现miRNA-28-5p在促进MSC增殖中发挥作用,且miRNA-28-5p可以激活PI3K/Akt信号通路。

Li等[18]从大鼠的MSC中提纯出外泌体,发现miRNA-124-3p在MSC-exo中大量表达。将MSC-exo 注射入ALI大鼠中,发现MSC-exo miRNA-124-3p可提高ALI大鼠存活率,并增强其肺组织中谷胱甘肽/超氧化物歧化酶活性。经miRNA-124-3p处理的大鼠BALF中巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量显著减少。上述结果表明,MSC-exo携带的miRNA-124-3p可改善ALI应激损伤。

3.3 外泌体通过调控自噬发挥作用 自噬是指细胞吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其包裹内容物,借此实现细胞代谢和某些细胞器更新。自噬在生理和病理过程中都可发生,其在ALI中所起的作用尚未完全阐明。Liu等[1]研究表明BMSC-exo在LPS刺激后的肺泡巨噬细胞中显著降低了Beclin-1表达。Beclin-1基因是一种自噬相关基因,与Bcl-2基因相互拮抗而调控自噬。BMSC-exo通过抑制肺泡巨噬细胞自噬而减轻LPS导致的ALI。而Wei等[2]研究表明,人脐带间充质干细胞(hucMSCs)释放的外泌体通过增强自噬和抑制炎症因子表达而缓解LPS诱导的ALI。

4 间充质干细胞来源的外泌体在新冠肺炎治疗中发挥作用

2020年，由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎在全球爆发。新冠肺炎患者死亡的主要原因是低氧性呼吸衰竭,最终导致ARDS[24]。新冠肺炎的大流行给全球公共卫生和国际经济带来巨大的负面影响[25]。外泌体含有与其来源细胞相似的成分,如MSC-exo与MSC在功能上一致,而MSC-exo有更多的优势,如穿透血液屏障、有较低的免疫原性、无肿瘤发生风险、可以大规模制造等,而且MSC-exo成本更加低廉,因此MSC-exo成为治疗新冠肺炎潜在治疗方案之一[26-27]。

Sengupta等[28]对24例新冠肺炎患者进行了临床试验研究以评估BMSC-exo的安全性和有效性。BMSC-exo经静脉注射后,细胞因子风暴显著减轻,患者缺氧情况显著改善,且72 h内无不良反应。Zhang等[29]表明表达hACE2的外泌体可以与细胞上的hACE2竞争性结合SARS-CoV-2的刺突蛋白,从而阻断病毒侵入宿主细胞。Khalaj等[30]认为外泌体作为一种新冠肺炎的新型治疗方法具有巨大的潜力,外泌体可降低肺炎症反应,使受损肺泡上皮和内皮细胞再生修复,防止肺纤维化。

在新冠肺炎大流行期间,我们一直在探寻关于外泌体治疗新冠肺炎合理有效的方法,并在临床试验方案中评估其安全性和有效性,这些研究成果对于SARS-CoV-2来说是非常有价值的。

5 总结与展望

不同细胞来源的外泌体作用差别很大。如MSC-exo可以预防早期缺氧引起的肺部炎症,修复内皮屏障,减轻肺水肿,恢复肺泡清除率,改善急性肺损伤患者的呼吸功能;而BALF中巨噬细胞的外泌体则会分泌促炎因子,促进肺部发生炎症反应;肺泡上皮细胞释放的外泌体可将炎症信号传递给活化的巨噬细胞而引发肺内炎症;EPC-exo则可以通过miR-126减轻ALI。

与药物治疗相比,外泌体治疗方法有很大的优势:①外泌体免疫原性较低,可以避免免疫应答激活;②外泌体作为一种新型疗法,其尺寸小可深入到大多数组织内部;③外泌体有良好的生物稳定性,可装载药物;④外泌体可保持良好的生物相容性,能携带多种类型的生物分子;⑤外泌体可对其表面特异性受体进行加工,以实现将治疗性分子作用于靶细胞等。这都使得其在治疗ALI中存在良好的应用前景。