大叶冬青质量控制方法的研究进展

陈颖，王存琴，方兰婷，姜新秀

(1.安徽省多糖药物工程技术研究中心，安徽 芜湖 241002；2.活性生物大分子研究安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241002；3.安徽省皖南植物药活性物质筛选与再评价工程实验室，安徽 芜湖 241002；4.皖南医学院药学院，安徽 芜湖 241002)

大叶冬青(IlexlatifoliaThunb.)为冬青科(Aqulfoliaceae)冬青属(Ilex)常绿乔木，多见于平原地区的灌木丛中，在浙江、江苏、安徽及福建等地均有分布[1]。具有清热解毒、消烦止渴、止痛的功效，常用于治疗咽喉痛、感冒发热、眼热和痢疾等症[2]，其主要包含三萜及其皂苷、黄酮和多酚类等化学成分[3-6]。其药理活性研究结果表明大叶冬青具有降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎等作用[7-9]。在化学成分与药理作用方面的研究成果显示大叶冬青具有临床药用与资源开发的重要价值。目前关于大叶冬青化学成分含量测定方面的研究渐渐趋于成熟，但在中国药典中还未建立大叶冬青的质量标准。为了进一步完善大叶冬青的质量控制，对近年来大叶冬青化学成分的分析方法进行了总结，以期为大叶冬青的化学成分研究和含量测定提供帮助。

1 高效液相色谱(HPLC)法

近代HPLC发展和普及速度飞快，仪器愈发先进，已经成为药企、医院、高校和研究所等单位的必备大型仪器。因其具有检测便捷，样品用量小，分析速度快等优点，已成为临床药物实验、医学检测化验、高校中药检测、环境卫生检测等分析领域最常用的分离分析技术。

1.1 三萜类成分

三萜类成分主要有五环三萜和四环三萜两大结构特征，在植物中，常以游离形式存在或与糖结合合成苷类或酯类，具有明显的结构特征，因其各官能团不同，表现出多种显著的生物活性[10]，是大叶冬青定性或定量的主要指标成分。

王存琴等[11]采集了22批不同批次的大叶冬青叶，选用高效液相色谱法检测冬青叶中六种三萜类化合物的含量，在色谱条件中选用Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，检测波长设为205 nm，流动相采用乙腈-0.4%磷酸水溶液不同比例洗脱，同时对22批药材进行指纹图谱分析。色谱图结果显示27-p-Coumaroyloxy ursolic acid、3β-Hydroxyurs-11-en-28，13β-olide、乌发醇等6种三萜类成分具有良好的分离性，不同批次大叶冬青中6种三萜类成分含量存在显著差异。14批同源样品指纹图谱相似度较高，均大于0.9，结果一致性较好。 10批不同来源的样品指纹图谱相似度较低。所建立的方法具有良好的稳定性和重复性，可为有效控制大叶冬青药材的质量提供依据。

熊果酸和齐墩果酸是极性相似的同分异构体，这使得分离更加困难。杨新河等[12]使用Betasil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱，流动相选用乙腈-水(95∶5)，紫外检测波长设置为210 nm，可以很好的分离、测定苦丁茶中熊果酸和齐墩果酸的含量。黄浩等[13]使用 Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，甲醇-0.03%磷酸(90∶10)为流动相，检测波长设置为215 nm，也可以很好的分离不同品种苦丁茶中的熊果酸和齐墩果酸。顾学方等[14]也采用HPLC法在色谱图上使不同品种苦丁茶中的熊果酸及齐墩果酸分离度大于1.5，同时采用外标法进行含量测定，其色谱条件是选择了Agilent HC- C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱，洗脱溶剂选用甲醇和磷酸水，检测波长设为215 nm。三种方法均能很好的分离检测苦丁茶中熊果酸和齐墩果酸，且含量测定结果分析发现冬青科冬青属的苦丁茶、大叶冬青质量较好，随着随贮存时间延长，化学成分含量可能会有所下降，综合以上方法，可以应对各个品种苦丁茶中熊果酸和齐墩果酸的含量测定，为进一步控制大叶冬青的质量提供方法依据。

汪雷等[15]采用HPLC法分析了26批来自不同地方及不同采收时间的大叶冬青叶中中α-香树脂素、羽扇豆醇、豆甾醇、和苦丁冬青苷 D 4种三萜类化合物的含量。其在色谱方法中选择了YMC-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)为流动相等比例洗脱，检测波长定为205 nm。26批药材中4种三萜类成分含量差异显著，与采集月份密切相关，建立的方法准确可行，重现性好。

1.2 三萜皂苷类成分

三萜皂苷是三萜苷元与糖结合成苷，其水溶液振摇能产生肥皂样泡沫。来源于多种中草药植物中，如人参、桔梗、甘草、酸枣仁等[16-17]，具有调节生理代谢、增强免疫系统功能、化痰、降低胆固醇、抗动脉粥样硬化、降低血压等作用[18-19]。关玥等[20]在大叶冬青化学成分研究的基础上，采用HPLC法测定了大叶冬青中大叶冬青皂苷F、大叶冬青皂苷C、苦丁冬青皂苷F等6种三萜皂苷的含量。在HPLC色谱条件中选择了Wonda Cract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相选用乙腈和水不同比例洗脱，检测波长设置为210 nm。含量测定结果表明大叶冬青中三萜皂苷的含量在不同产地排序从高到低分别为浙江、江西和安徽。该方法可以同期检测大叶冬青中6种三萜皂苷成分的含量，能快速综合的评价大叶冬青药材质量，促进大叶冬青和苦丁茶药材质量控制的提升。杨滔[21]等采用采用高效液相色谱法测定苦丁茶7种三萜皂苷的含量，即大叶冬青苷G、苦丁冬青苷A、大叶冬青苷H和苦丁冬青苷G等。色谱条件中的色谱柱是YMC pack ODS-A(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相是乙腈和水不同比例洗脱，在210 nm处设置紫外检测波长。高效液相色谱图可以看出在此条件下7种三萜皂苷分离度良好，旁边无明显干扰成分，从含量测定结果中得出，大叶冬青中三萜皂苷总量在广东和广西两个地域相差不大。方法简便、重复性好、准确度高，可作为苦丁茶药材质量控制标准。张俊清等[22]采用高效液相色谱法，色谱条件选用Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5μm)色谱柱，流动相选用乙腈-水(36∶64)，在紫外228 nm处设置苦丁苷A的检测波长，在紫外261 nm处设置苦丁苷D的检测波长，测定海南大叶冬青叶中苦丁苷A和D的含量，结果表明，大叶冬青中苦丁苷A和D的含量较高，推测其可以作为大叶冬青质量控制的指标成分。倪帅帅等[23]利用高效液相色谱-二极管阵列检测器-蒸发光检测器(HPLC-DAD-ELSD)法对综合分析苦丁茶的指纹图谱，确定苦丁茶黄酮和皂苷的分布特征。指纹图谱分析结果表明10批苦丁茶的指纹图谱相似度均大于0.90，表明该指纹图谱方法具有良好的准确性和重复性，重复性佳，可促进苦丁茶冬青药材的质量控制的发展。对苦丁茶HPLC-DAD和HPLC-ELSD指纹图谱的比较分析表明，苦丁茶中黄酮类化合物的含量远低于苦丁茶皂苷类化合物的含量。

1.3 黄酮及多酚类成分

多酚物质的种类复杂，主结构特征明显，按结构大致可分为类黄酮、芪、酚酸和木脂素。黄酮类化合物的基本母核是2-苯基生色酮结构，特征突出，但种类颇多，主要以游离形式存在于中草药中。具有抗氧化、强化血管壁、抗动脉粥样硬化和降血脂等作用[24-25]。王存琴等[26]采用HPLC法同时检测大叶冬青叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸等10种多酚类化学成分，分析从不同产区和不同收获期采集大叶冬青叶中10种多酚类成分的含量是否存在差异，同时还选用体外抗氧化化学方法DPPH法评估其抗氧化活性。从含量测定结果分析得出大叶冬青叶中多酚类成分的总含量丰富，适合秋冬采收。从方法学实验考察结果得出，该方法重复性好，方便快速，准确度高，可为制定大叶冬青的质量标准提供科学依据。尹礼国[27]采用HPLC法检测2种川产苦丁茶中芦丁的含量，其中女贞子的芽叶和老叶分别为(0.118±0.011)%，(0.083±0.012)%，粗壮女贞的芽叶、老叶(0.082±0.012)%，(0.065±0.008)%。田建平[28]等选择超声提取药材中的绿原酸，采用RP-HPLC法检测6种冬青属苦丁茶中绿原酸的含量，其中苦丁茶采自不同的生长阶段、不同时期、不同区域等。对所有批次苦丁茶中绿原酸的含量分析结果显示苦丁茶冬青、霍山冬青、大叶冬青中绿原酸含量较高，野生苦丁茶冬青老叶中绿原酸含量较高，其含量随贮存时间延长有所下降。Yi H等[29]首次建立了一测多评多定量分析(QAMS)方法，采用HPLC法同时测定苦丁茶中18种活性成分。以芦丁、异绿原酸 A 和苦丁苷A作为内标物质，结果表明，在不同的色谱条件下，各化合物的相对校正因子具有良好的重现性。

1.4 其他成分

马应丹等[30]首先提取纯化了苦丁茶的总嘌呤碱，然后通过HPLC分离和测定嘌呤碱。 结果表明，这种苦丁茶不仅含有咖啡因、茶碱和可可碱，还含有苦丁茶特有的嘌呤碱成分苦丁碱。李宏杨[31]首次采用HPLC法测定建苦丁茶冬青中白桦酯酸的含量，分析条件为C18反相柱，流动相选用甲醇-0.2%磷酸水溶液为84∶16，检测波长设置为210 nm，含量测定结果显示白桦酯酸的平均含量为0.28%，分析方法快速可靠，为大叶冬青的质量控制方法的建立提供了基础资料。

2 其他方法

Zhou J等[32]建立了超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱法(UPLC-qTOF-MS/MS)，快速分离鉴定苦丁茶中的化学成分。通过UPLC-qTOF-MS/MS对苦丁茶进行色谱分析，鉴定出53种化合物，其中确定已知化合物18种。总体数据结果显示苦丁茶的主要成分是酚酸和三萜。该方法简洁有效，为接下来苦丁茶的全面质量控制研究提供了一种潜在的方法。

冯琳琳等[33]首次在一测多评法(QAMS)的基础上采用液相色谱-质谱联用技术同时检测苦丁茶冬青中山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、苦丁冬青皂苷 C、苦丁冬青皂苷 E和苦丁冬青皂苷 D等 6种成分的含量。选择含量较高且稳定的苦丁冬青皂苷C为内标物，测定和计算其它5种成分的相对校正因子，然后利用计算出的相对校正因子推算其它5种成分的含量。同时也用外标法(ESM)计算出6种化学成分的含量，将QAMS与ESM计算出的含量进行对比分析，分析结果提示两者无明显差别。说明QAMS测定苦丁茶冬青中6种成分的方法快速准确，且节约标准品，是苦丁茶冬青质量控制的优选方法。

Fan C等[34]建立了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用(UPLC-QTOF-MS)多组分测定与指纹图谱分析相结合的方法，用于大叶冬青叶的质量评价与控制。该方法具有快速、高效、准确的优点，可在13 min内完成一次色谱多组分测定和指纹图谱分析。实验结果表明，采用UPLC-QTOF-MS技术的多成分测定和指纹图谱分析相结合的策略是一种有效的快速分析药物的方法，在产地鉴别、真伪鉴定和药物质量控制等方面具有广阔的前景。旷春桃等[35]采用氯化铝法和硝酸铝-亚硝酸钠法两种化学方法测定大叶冬青叶中的总黄酮含量。2种方法在实验过程各环节及原理对比表明氯化铝法在大叶冬青叶提取液中总黄酮的含量测定稳定性与可靠性优于硝酸铝-亚硝酸钠法。王新等[36]以传统方法水提醇沉法提取苦丁茶冬青叶多糖，为得到较好的显色条件，选用了正交实验优化显色条件。多糖的含量测定选用了经典方法苯酚-硫酸法。此法为大叶冬青叶多糖成分的进一步研究开发与应用提供了参考依据。熊波等[37]结合乙醚超声萃取和水蒸气蒸馏两种传统实验方法提取苦丁茶冬青中的挥发油，然后用气相色谱-质谱联用法鉴定出挥发油中的57个成分，鉴定结果表明挥发油中主要是醇、醛、酮、醚、脂肪酸、脂肪酸酯及含氧萜类等化合物。

3 讨论

综上所述，大叶冬青物产丰富，具有多样的化学结构，其主要的含量测定与质量控制的分析方法是HPLC法。HPLC法因其简单易懂，且操作方便，深受研究者青睐，但其对化学成分含量要求较高，灵敏度次于UPLC和液质联用技术等。而目前采用UPLC、LC-MS方法研究大叶冬青化学成分含量的文章较少，这和仪器本身价格昂贵、操作较为复杂，原理理解有难度等因素有关。主要总结了大叶冬青含量测定与质量控制的相关文章，为后续大叶冬青的化学成分研究和质量标准的建立提供一些帮助和理论依据，促进其化学成分的提取与开发利用。