靶向调节肿瘤微环境治疗乳腺癌的研究进展 ①

牛振宇，田 晶

(桂林医学院，广西 桂林 541199)

根据GLOBOCAN2020数据预测，2020年全球乳腺癌新发病例约230万人，占癌症新发病例数总和的11.7%，已超过肺癌位居全球癌症发病率第一位[1]。在中国，乳腺癌发病率也呈逐年上升趋势，预计2020年乳腺癌发病率可达41.6万人，同样成为中国女性发病率第一的恶性肿瘤[2]。虽然早发现早治疗可大大提高乳腺癌患者的生存率，但随着时间的推移，人们发现常规综合治疗手段的发展遇到了瓶颈，难以进一步降低术后患者乳腺肿瘤的转移率和复发率，且不良反应明显。因此，寻找新的乳腺癌发生机制以新的生物学靶点变得尤为重要。

肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)是指正常细胞在向恶性细胞转化过程中与细胞一起产生变化并为其提供相应支持的微生态系统，即肿瘤或肿瘤干细胞生存的内环境。作为肿瘤细胞赖以生存的重要场所，TME成分十分复杂，包括多种类型的细胞(免疫细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等)、细胞外基质及大量活性分子(细胞因子、激素、生长因子等)。有研究结果表明，TME中的细胞成分与肿瘤的发生、发展以及转移密切相关，所以靶向TME为肿瘤治疗提供了新的思路和新的研究方向[3]。本文综述了TME在乳腺癌细胞生长、转移和产生耐药性方面的作用与分子机制，以及靶向肿瘤微环境进行抗乳腺肿瘤治疗的最近研究进展。

1 乳腺癌微环境中内皮细胞

在肿瘤微环境的长期刺激下，正常血管内皮细胞的形态、表型、功能甚至基因表达均会发生异常改变，最终转化成为肿瘤内皮细胞(tumor endothelial cells， TECs)。不同于正常内皮细胞，TECs管壁上有着大量的通道和孔洞，因而具有高通透性，同时细胞间存在基底膜不完全或缺失的情况，这些特点均利于肿瘤细胞穿透血管壁从而完成远处转移。此外，内皮细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受体-1和VEGF受体-2表达水平较正常内皮细胞上调，因此对于VEGF的敏感性也更强，处于一种高增殖、高转移的活化状态。所以TECs能够促进肿瘤新生血管的形成，进而影响癌细胞的生长和转移。最新研究发现，肿瘤内皮细胞还可释放多种血管内皮衍生因子(统称为angiocrine)，调控血管生成和肿瘤生长。Ghiabi等[4]报道，TECs在与乳腺癌细胞接触后，Jag1配体过表达，从而激活notch信号通路，形成一个促进癌细胞生长和转移的壁龛。Lee等[5]则证明，血管内皮细胞与肿瘤细胞相互作用后，可使癌细胞获得干细胞样特性并促进其发生上皮间质转化。

2 乳腺癌微环境中免疫细胞

随着对肿瘤发生发展与免疫系统相关性的深入了解，人们逐步认识到免疫细胞在发挥免疫功能的同时，其所参与形成的炎性肿瘤微环境反而对肿瘤进程有着促进作用。因此，炎症微环境被认为是肿瘤的十大基本特征之一。目前已知的参与肿瘤微环境的炎症细胞主要包括巨噬细胞、肥大细胞、淋巴细胞等。

2.1 肿瘤相关巨噬细胞

肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)，分为M1和M2两种类型。机体主要通过巨噬细胞M1型和M2型间的平衡维持机体平衡和调控炎症反应[6]。在乳腺癌微环境中，非极化巨噬细胞在2型T辅助细胞(Th2细胞)因子的刺激下，可转化成具有独特表型的肿瘤相关巨噬细胞，为肿瘤微环境中数量最多的免疫细胞。大量临床分析表明，原发性乳腺癌中肿瘤相关巨噬细胞的浸润程度与患者预后密切相关，高TAM浸润可显著增加患者淋巴转移风险、缩短生存期。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2， COX-2)作为花生四烯酸代谢的重要限速酶，正常情况下体内仅表达微量，但在肿瘤组织中被发现高表达于巨噬细胞、内皮细胞等，且高表达COX-2的TAMs细胞数量与乳腺癌淋巴结转移情况密切相关[7]。上调TAMs中COX-2的表达，可激活下游Akt信号通路，促进乳腺癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，提高肿瘤细胞的上皮间质转化和转移能力。与此相应，COX-2特异性抑制剂依托昔布能够有效抑制TAMs分化，使其丧失M2巨噬细胞特性，M2型TAMs表达趋化因子CCL17、CCL18、CCL22和CCL24能增加VEGF、IL-8、MMP、转化生长因子。同时，下调细胞内多个肿瘤转移相关因子的表达，如VEGF-A、VEFG-C和MMP-9，减少BALB/c小鼠乳腺癌模型的肺转移[8]。此外，TAMs可通过分泌CCL2激活乳腺癌细胞中PI3K/Akt/mTOR 信号通路，增加乳腺癌的耐药性，降低癌细胞对于他莫西芬的敏感性，同时刺激巨噬细胞的募集。与此相反，耐药的乳腺癌细胞所分泌的TNF-α会激活TAMs中 mTORC1-FOXK1信号途径，促使其向M2表型极化，从而分泌更多的CCL2，最终在TAMs与乳腺癌细胞中形成正反馈环路[9]。在肿瘤微环境中，TAMs主要向M2型巨噬细胞极化促使肿瘤向恶性肿瘤进展[10]。相关研究结果还表明，肿瘤相关巨噬细胞分泌的多种因子，如TNF-α、IL-6等，通过调控癌细胞中EGFR/PI3K/Akt、NF-κB/STAT3/ERK等途径，也可引起乳腺肿瘤的耐药性[11]。

2.2 肿瘤相关肥大细胞

研究发现，肥大细胞的特异性标志物类胰蛋白酶在乳腺癌患者血清中的浓度较正常人增加4倍以上，提示乳腺肿瘤中存在大量肥大细胞浸润。Samoszuk和Marech等则证实，乳腺肿瘤组织中类胰蛋白酶水平和浸润的肥大细胞数量均与微血管密度呈显著正相关[12-13]。此外，与非转移性乳腺癌相比，类胰蛋白酶阳性的肥大细胞比例在转移性乳腺癌患者淋巴结中明显增高，提示肥大细胞可能与淋巴侵袭转移有很高的相关性[14]。进一步研究发现，肥大细胞所分泌的类胰蛋白酶可与血管内皮细胞上蛋白酶激活受体-2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)结合，促进内皮细胞的增殖。类胰蛋白酶还可促进乳腺癌细胞中MMP-2、TIMP-2的表达，增强其侵袭转移能力。另一方面，不同来源的临床数据分析显示，乳腺肿瘤中的肥大细胞浸润具有保护作用。肿瘤基质中肥大细胞的存在对于乳腺癌患者预后有积极影响，特别对于未发生淋巴结转移的患者，肥大细胞浸润程度与生存率呈强相关性[15]。Naik等[16]也观察到，腋窝淋巴结中肥大细胞数量越多，患者预后越好，并且与肥大细胞在淋巴结中分布模式差异无关。因此，有部分学者认为，肥大细胞浸润可作为一个独立的良好乳腺癌预后标志。可见，有关肥大细胞浸润对乳腺肿瘤发展过程的影响仍然存在很大争议，需要进一步研究来阐明肥大细胞的确切作用。

2.3 肿瘤浸润淋巴细胞

肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TILs)的作用机制主要有直接杀伤作用、死亡受体介导的细胞凋亡、分泌炎性细胞因子介导的细胞溶解与凋亡[17]。Lotfinejad 等[18]对共计1152名乳腺癌患者进行Meta分析后发现，肿瘤浸润淋巴细胞与三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)临床病理特征(肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移)不相关，但高水平TILs患者治疗后无病生存期和总生存期会明显延长。Denkert等[19]研究发现，在人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)过表达型乳腺癌患者中，高水平TILs患者接受新辅助化疗后无病生存时间也会相应延长，可总生存期不会发生明显改变。而大量关于TNBC患者的临床数据分析中发现，淋巴细胞在早期患者肿瘤基质中浸润密度的升高可明显降低患者复发风险和死亡风险，提高完全病理缓解率。但是，TILs在Luminal型乳腺癌细胞中的作用目前尚不明确。Gao与Waks的研究结果相似，高水平TILs在Luminal/HER2-乳腺癌亚型中与完全病理缓解率和患者生存率不相关，不可作为预后评估及疗效预测指标[13，20]。一些研究结果表明，高水平TILs与Luminal型乳腺癌接受芳香化酶抑制剂治疗效果差有关，同时此类患者在接受新辅助化疗效果会更差。Ohno 等[21]报告高水平TILs的Luminal/HER2-乳腺癌患者经过辅助化疗后，总体生存率要高于低水平TILs患者，预后较好。由此可以看出，在不同分子分型的乳腺癌中，TILs 的疗效预测及预后评估的临床价值存在差异，不能一概而论。

3 乳腺癌微环境中成纤维细胞

肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，TAFs)是肿瘤微环境中最主要的基质细胞，一方面其产生的ATP和代谢中间体可被邻近的癌细胞所摄取后直接供能或转化重新用于ATP合成；另一方面通过分泌生长因子、细胞因子以及趋化因子等对肿瘤细胞和肿瘤微环境进行调控[22]。肿瘤相关成纤维细胞通过直接作用或旁分泌的方式影响免疫细胞功能或减少免疫细胞与癌细胞的物理接触，以降低机体免疫系统对癌细胞的识别和杀伤，这是促进肿瘤免疫逃逸的重要环节[23]。目前为止，CAFs被证明分泌的生长因子包括成纤维表皮生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子和基质细胞衍生因子1等。在乳腺肿瘤组织中，Tyan等[24]最先明确了癌细胞可经细胞旁途径刺激成纤维细胞中肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)的分泌，从而促进癌细胞本身的生长和转移。Suh等[25]则通过体内外实验证明，CAFs通过旁分泌成纤维表皮生长因子2(fibroblast growth factor-2，FGF2)作用于雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231上FGF受体1(FGFR1)，促进癌细胞的增殖、迁移与侵袭。此外，肿瘤相关成纤维细胞所分泌的细胞因子和趋化因子TNFα和IL1β被证明可以开启基质细胞与TNBC细胞向侵袭性恶性表型的转化，上调CXCL8/IL8、CCL2和CCL5的表达，促进癌细胞的侵袭和转移能力。肿瘤转移过程中的一个关键步骤是癌细胞的上皮间充质化，而CAFs被证实可以分泌IL3、EGF等因子，激活下游p38MAPK、Wnt通路，诱导乳腺癌细胞间充质样改变、干细胞化以及侵袭。同时，肿瘤相关成纤维细胞还参与了肿瘤微环境构建。Raz等[26]研究表明，骨髓来源的基质细胞(BM-MSCs)是CAFs的前体细胞之一，其分化形成的成纤维细胞在乳腺癌原发灶和肺转移灶中均大量存在，并且能够引起特定的炎症反应，促进血管生成与转移前微环境的形成，从而支持肺转移。

4 靶向乳腺肿瘤微环境的临床治疗

4.1 靶向TAEs的临床治疗

新生血管的生成是肿瘤生长的关键因素之一，该过程依赖于肿瘤相关内皮细胞的活化与增殖。VEGF被公认为活化血管内皮细胞的重要因子，与内皮细胞表面VEGF受体相结合后，激活下游一系列信号分子(MAPK/ERK、PI3K/AKT)，促进内皮细胞增殖、迁移与血管生成。因此，靶向VEGF-VEGF受体的单抗类药物和酪氨酸激酶抑制剂一直是肿瘤靶向治疗的研究热点之一。作为第一个问世的血管生成靶向药物，拮抗VEGF-A的贝伐珠单抗单药或联合用药均被证明对转移性乳腺癌有一定疗效。Du等[27]对共计5210例乳腺癌患者进行Meta分析，结果显示，与单纯化疗相比，贝伐珠单抗联合化疗更能有效改善晚期乳腺癌患者客观缓解率和中位生存期，但高压尿、蛋白尿、粒细胞数量减少及周围神经毒性等严重不良反应的发生率增加。因此，贝伐珠单抗已被美国FDA撤销其用于乳腺癌治疗的认证。目前，靶向抑制VEGF受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂主要有舒尼替尼、索拉非尼，临床上多用于晚期乳腺癌治疗。但是大量临床研究发现，舒尼替尼单药应用对晚期乳腺癌治疗效果有限，无法有效延长患者无进展生存期和总体生存期，且约三分之一的患者出现不良反应，因此，舒尼替尼不被推荐用于晚期乳腺癌的治疗[28]。同样，索拉菲尼单药治疗的2期临床研究也未能证明其明显改善了晚期乳腺癌患者的无进展生存期，无一例患者出现部分或完全缓解，因此，索拉菲尼也不被指南推荐作为单药治疗晚期乳腺癌[29]。究其原因，舒尼替尼和索拉菲尼均作用于癌细胞中多个靶点、多条通路，因此，治疗中可能引发“脱靶”效应。在此基因上，研究者开始探讨多种小分子酪氨酸激酶抑制剂联合化疗，但严重的药物不良反应很可能会导致临床结局不理想，仍需进一步研发新的抗血管生成小分子酪氨酸激酶抑制剂，展开相关临床研究。

4.2 靶向TAMs的乳腺癌治疗

TAMs主要来源为外周血单核细胞，在趋化因子的作用下募集入肿瘤组织中并分化为巨噬细胞，参与肿瘤的发生发展。研究发现，CSF1/CSF1R信号轴的激活可触发趋化因子的级联反应，诱导单核细胞的成熟及黏附至乳腺癌细胞，接着激活乳腺癌细胞内PI3K-Akt信号通路，促进癌细胞的肺转移[30]。因此，小分子酪氨酸激酶抑制剂PLX 3397通过靶向抑制肿瘤相关巨噬细胞中CSF1R表达，可抑制TAMs活性并促进T细胞在肿瘤组织中的浸润。目前，一些临床试验正在尝试PD1抑制剂联合CSF1R小分子抑制剂治疗乳腺癌，希望二者协同效应可促进肿瘤组织中T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的浸润增加，达到长期抑制肿瘤生长甚至防止远处复发的目的[31]。另外，有效诱导TAMs复极化为具有抗肿瘤作用的M1型巨噬细胞是临床治疗乳腺癌的另一策略。近年来，利用纳米复合材料实现光免疫疗法成为乳腺癌治疗的研究热点。可将TAMs从M2型转化为M1型，实现从“冷肿瘤”(无T淋巴细胞浸润)向“热肿瘤”(T淋巴细胞浸润)的转变，从而增强免疫治疗效果，逆转肿瘤的耐药性[32]。同时，多种中医药单体或中药复方被证明也可促进肿瘤相关巨噬细胞的复极化。比如，黄芩主要活性成分黄芩苷可通过诱导巨噬细胞向M1型巨噬细胞复极，进而抑制TGFβ1表达，发挥抗乳腺肿瘤作用[33]。消癖颗粒中关键生物活性化合物宝霍甙-I则可抑制TAMs的M2表型极化，减少CXCL1表达和分泌，显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭[34]。

4.3 靶向CAFs的临床治疗

乳腺癌细胞与成纤维细胞间存在相互作用。比如，三阴性乳腺癌细胞可以分泌Hh因子，与附近CAFs上受体结合后，激活SMO促进细胞中FGF5的合分泌，以维持肿瘤细胞的干性。研究者对12例晚期TNBC癌患者给予SMO抑制剂联合多西他赛治疗，共有3例患者病情得到控制，1例患者出现完全缓解[35]。CAFs与肿瘤微环境中免疫细胞的抑制也密切相关。研究发现，激活中CAFs中TGF-β能在小鼠乳腺癌模型中阻断T细胞的浸润，并促进PD-L1抗体的效应，而PD-1/PD-L1信号通路的异常激活有助于肿瘤的免疫逃逸[36]。因此，研究者设计了靶向TGF-β和PD-L1的联合治疗方案，所制备的TGF-β/PD-L1双特异性抗体已在小鼠乳腺癌模型中取得成功，目前正处于临床研究中[37]。

5 展望

综上所述，肿瘤微环境作为乳腺癌细胞赖以生存的“土壤”，在肿瘤的发生发展中起到重要作用。因此，深入研究乳腺肿瘤TME的特征，可为乳腺癌的治疗提供新思路和可能的新靶点。值得一提的是，肿瘤微环境是一个复杂的共生系统，在肿瘤进展的不同阶段，TME细胞的表型和功能都会发生动态变化，并且肿瘤不同分子亚型的TME存在差异。因此，精准靶向肿瘤微环境中的某一细胞发挥抗乳腺肿瘤的作用需要更多的研究投入。相信通过对于肿瘤微环境的不断深入研究，乳腺癌的治疗将取得更大的突破。