菌种保藏室建设与管理初探

罗小叶，王晓丹 ，邱树毅

（1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025）

贵州省发酵工程与生物制药重点实验室是专门从事贵州传统发酵食品及白酒酿造的省级重点实验室，是贵州省统发酵工程研究中心和人才培养基地。依托贵州省丰富的生物资源和传统发酵资源优势，针对贵州区域发酵产业经济发展的需求，开展相关研究，已经形成发酵微生物资源挖掘与利用、发酵功能生物分子分离与风味物质解析、发酵食品工艺创新与现代食品技术应用、发酵食品安全检测技术等研究方向，经过多年的建设和发展，实验室在学科建设、人才培养、导师队伍的建设、科学研究上取得了很大的发展，并在加强实验室管理、提升重点实验室创新能力、促进重点实验室“开放、流动、联合、竞争”等方面开展了一系列的工作。在微生物学研究工作中，微生物是基本材料，也是深加工产品的重要生产原料。重点实验室主要涉及贵州微生物资源的挖掘与利用，主要包括酱香型白酒固态酿造微生物、贵州特色米酒微生物、贵州特色果酒微生物、贵州特色酸汤微生物及其他食品微生物资源的挖掘与利用，涉及的微生物包括细菌、酵母、霉菌、放线菌及高温放线菌等代表菌株。菌种保藏为持久而有效利用微生物资源提供了保证[1]，重点实验室实行集中保藏、科学的育种传代及分类管理，并负责同其他高校及科研院所相互交流，以及研究保藏菌种的科技情报工作，以使各类菌种长期满足科研需要，更好地为科学研究和贵州产业发展服务。

一、菌种保藏室建设与管理

（一）菌种保藏室建设的历史追溯

世界上约有550个菌种保藏机构，最早意识到菌种保藏意义的是捷克斯洛伐克微生物学家Frantisek Kral[2]。为了更好地将这些菌种服务于当时的微生物学研究和应用，他先后公布了菌种目录，该目录共63页，有800个菌株，包括引起人或动物流行性疾病的致病菌、食品发酵生产的细菌，还有真菌、藻类和厌氧菌[2]。部分私立菌种保藏机构，主要设在巴黎、伦敦、比利时和日本等有关微生物的研究所，但不幸的是现今无法找到这些保藏机构的资料，对于微生物菌种保藏工作的重要性令人深思。经过大量的筛选及微生物工作，分离筛选得到微生物菌种，因此，我们更应加以保护和利用珍贵的微生物资源。

（二）菌种保藏的目的与任务

就微生物学工作者而言，微生物保藏是一项非常重要的工作，不仅涵盖原料菌种的分离筛选、微生物纯化、理化分子鉴别及储藏保管，还与微生物生理学、生物化学、生态学、遗传学、形态学、分子生物学等学科有着必然联系[3]。根据国际及国内保藏中心的发展与任务，菌种保藏中心主要是对现今的各种微生物进行有效保存，保持其形态及功能特性，避免在保藏期间和生产过程中产生死亡或者变异，从而为微生物学研究提供最基本的原料[3]。

（三）国家级菌种保藏中心的概况

我国国家级菌种保藏管理中心主要负责全国微生物菌种资源的收集、鉴定、评价、保藏、供应及国际交流任务[4]，目前国家级微生物菌种保藏中心有：中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）、中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）、中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）、中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）、中国林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC）、中国抗生素菌种保藏管理中心（CACC）、中国医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）、中国典型培养物保藏中心（CCTCC）等[5]，例如目前本重点实验室大部分教师的微生物均保藏在中国典型培养物保藏中心，该保藏中心是于1985年由国家知识产权局（原中国专利局）指定、经教育部（原国家教委）批准建立的专利微生物保藏机构，受理国内外用于专利程序的微生物保藏菌种保藏，为各团队知识产权保护及转化起到保驾护航作用。

（四）重点实验室菌种保藏室的建设与管理

1.重点实验室菌种保藏室的建设。重点实验室立足于贵州，面向西部，通过配套完善的实验室仪器设备和实验室条件，依托国家重大科技计划专项、国家自然科学基金及地方重大科技计划专项，开展发酵工程与生物制药领域的应用基础理论与技术研究，建设一个产学研紧密结合、人才培养和研究开发同步的技术研发平台，以及一支具有较高创新能力的学术团队。目前，实验室在贵州从学科建设、人才培养、科学研究、社会服务等方面较好地发挥了技术支撑和引领作用优势，提升了贵州省发酵工程与生物制药的水平和创新能力，缩短了与国内外的科技水平差距，推进了贵州省发酵工程与生物制药产业快速、稳定、健康发展。

笔者在重点实验室开展科研工作的同时，参与了实验室的建设与管理工作。由于重点实验室主要从事发酵与生物制药科学研究，其中涉及的微生物尤其众多，菌种微生物资源事关生物技术创新的未来，菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，也是与微生物有关的生产部门的重要生产资料。微生物具有生命活力，其世代时间一般很短，在传代过程中易发生变异甚至死亡。因此，菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。

自重点实验室成立建设至2017年11月，实验室各类微生物菌种保藏一直存在一大问题：缺乏统一的保藏点及保藏方法对整个重点实验室的微生物菌种进行保藏，重点实验室各科研团队出现各自为政的状态，难以将整个重点实验室的微生物资源进行挖掘与应用。为解决此问题及更好地挖掘微生物资源，2018年，在重点实验室主任及各位教师的指导与支持下，笔者在贵州大学酿酒与食品工程学院崇德楼454实验室筹备并建立了重点实验室的菌种保藏室，面积约30平方米，菌种保藏室现有仪器设备包括普通微生物常用的培养基、化学试剂及检测仪器设备，以满足微生物培养、保藏及检测。2020年下半年已经将整个重点实验室各个课题组的所有菌种保藏在重点实验室，保藏的微生物类型包括酵母（218株）、霉菌（226株）、细菌（318株）、高温放线菌（10株）、放线菌（5株）等微生物，这些微生物主要以贵州传统发酵酿造食品为原料分离筛选得来，主要包括酱香型大曲、酱香型酒醅、米酒、酸汤、酸菜、果酒等原料，菌种类型十分丰富，功能特性比较多样，微生物保藏方式包括4 ℃斜面保藏、甘油保藏、-80 ℃超低温冻干保藏等保藏方式。为便于菌种的存取，经过实地考量，在-80 ℃超低温冰箱中制作菌种保藏架放入冰箱中，再将各菌株按照各课题组及各菌种类型分门别类放入保藏架内，并在架子外侧编上编号，十分便于菌种的快速搜索与存取，在节约时间的同时，减少了微生物染菌的可能。

2.重点实验室菌种保藏室的管理。重点实验室菌种保藏室的建设与运行为各类微生物的保藏及使用提供便捷的通道，作为重点实验室菌种保藏室的负责人，为更好地规范管理菌种保藏室及重要菌种，制订《贵州省发酵工程与生物制药重点实验室菌种保藏室保藏申请流程》，按照以下流程完成菌种保藏工作，具体要求如下：与保藏室负责教师取得联系并填写菌种保藏申请表；准备好需保藏的菌种，根据菌种选择合适的保藏方法并告知负责教师保藏条件；菌种保藏期间如要取出菌种，需提前与负责教师联系方可取出菌种，不得私自拿取；在保藏期间需与负责教师一起定期检查菌种的存活率、种株纯度及其有关特性；本保藏中心只接收用于发酵及食品生产用的有益无害菌种，具有毒性及传染性的菌种或病毒不在保藏范围。

其次，根据重点实验室菌种保藏中心的实际情况，制订《贵州省发酵工程与生物制药重点实验室菌种保藏室菌种保藏与管理办法》，该办法包括菌种各种保藏方法的详细概述及菌种检查与复壮，办法规定的具体内容根据本保藏室具体实际情况作出相应调整。菌种保藏分四个阶段：（1）挑选特征典型的纯菌菌落；（2）确定保藏的合适菌体形态；（3）选择最适宜的保藏方法进行保藏；（4）定期对保藏的菌种进行检查，保藏期满应及时进行移种。保藏方法包括直接传代保藏法、液体石蜡保存法、沙土管保藏法、麸皮保藏法、滤纸保藏法、液氮超低温保藏法、冷冻真空干燥保藏法。具体的保藏方法在以后实际保藏工作中根据各个课题组的微生物类型而定，比如在重点实验室中，有用于食醋酿造的醋酸菌、用于米酒酿造和酱油酿造的霉菌、用于果酒啤酒发酵的酵母、用于白酒酿造的霉菌细菌及酵母、用于酸汤和发酵辣椒酱的乳酸菌等类型，比如霉菌适合沙土保藏，酵母和细菌适合液氮或者冷冻保藏等，需要根据各个课题组的实际微生物而定保藏类型，而不能“一法通用”——这对微生物功能特性保持是非常不利的；在实际菌种保藏室管理工作中需定期对微生物进行污染检查及特性检查，保藏期满后要及时进行移种，而不是保藏在载体中就是几年不管——这对发酵工程重点实验室特有微生物资源的损失是非常严重的。微生物菌种是科研工作的基础，对于在菌株筛选、保藏、管理方面有突出贡献的，应适当予以奖励；由于保藏方式不妥或管理疏漏，导致菌株死亡或外泄的，需根据具体情况，报告重点实验室主任，给予必要的惩处。

二、菌种保藏室的应用成果

（一）服务科研

重点实验室菌种保藏室已经投入使用两年多，建设管理下使用效果较好，相对于之前实验室微生物菌种各自为家、杂乱无章的状态，实验室各个课题组微生物都能得到有效保藏与利用；重点实验室主要从事贵州特色发酵食品的研发，各类微生物在其中起到举足轻重的作用。在重点实验室发展建设中，主要以微生物为中心，开展各项科学研究，近两年来，通过重点实验室菌种保藏室建设，各科研团队共计承担国家级项目10项，省部级项目20余项，发表学术论文100余篇，获得授权发明专利13项，省部级科学技术奖励2项，参与制定行业标准7项，产学研合作经费700余万元。

重点实验室菌种保藏室主要应用于各类微生物的保藏管理，这些功能微生物均在菌种保藏室及中国典型培养物保藏中心保藏，大部分功能微生物各课题组均对其功能及代谢开展研究，应用这些功能微生物申请获批一系列科研项目，如利用功能芽孢杆菌及酵母进行的研究，包括贵州酱香型白酒品质提高与丢糟高效利用关键共性技术研究及示范、高品质酱香型白酒酿造工艺优化、利用功能微生物强化易地生产高品质酱香型白酒关键技术研究、产白酒醇甜风味物质微生物筛选及关键技术研究、高产酯化酶的紫色红曲霉在提高浓香型青酒品质的应用、利用酱香白酒丢糟生产低度果香型白酒的工艺研究及示范、利用功能乳酸菌进行浓香型白酒酒醅中耐酸乳杆菌产酸特性及酸胁迫应答机制研究 、利用高温放线菌对酱香型大曲中高温放线菌的分离筛选及摇瓶液体发酵条件优化 ，以及研究传统发酵酸汤及米酒品质研究与新产品开发等项目。同时，利用重点实验室保藏的一系列微生物开展的研究也获得一系列国家及省奖项。重点实验室各项科技成果也更利于进行科技成果产业化应用及开展与外单位的合作应用研究，将科学技术转化为生产力，推动贵州特色产业的发展。

（二）辅以教学

虽然贵州省发酵工程与生物制药重点实验室主要以科学研究服务产业为主，但是在教学中，也扮演着重要角色。为了更好地将各门专业课程理论教学与实践相互融会贯通，充分利用实验室各项资源，重点实验室也为本科教学中的本科生提供开放平台，包括实验场所、仪器设备等，使学生能在导师指导下进行SRT实验、实验室开放项目、大学生创新创业大赛、互联网+创业大赛等项目的研究。重点实验室主要以发酵产物为研究内容，在课余教学过程中，学生利用菌种保藏室的功能酵母制作米酒、啤酒、樱桃酒、蜂蜜茶酒、茶啤酒、猕猴桃酒、苦荞酵素、蓝莓酒，利用功能霉菌制作霉豆腐、特色酱油，利用功能乳酸菌发酵酸奶、特色醋等产品。一方面，使学生全面回到课堂、回到教室；另一方面，培养了学生综合提出问题、解决问题的能力。

重点实验室菌种保藏室的建设与管理运行为各类微生物的保藏及使用提供便捷的通道，也为了解贵州省发酵产业特有微生物资源提供有力支撑。今后，作为重点实验室菌种保藏室的负责人，笔者会加强保藏室的有效利用，做好微生物菌株的分离鉴定、筛选保藏，做好为重点实验室各位师生的服务工作，保藏好实验室珍贵的微生物资源特性不退化，挖掘出更多的有用微生物资源，实行集中保藏、科学的育种传代及分类管理，并积极主动和贵州省内及全国其他高校科研单位交流，将课题组的微生物资源有效利用；加强对菌种保藏工作的研究与探索，与大数据信息化相结合，使各类菌种长期满足实验室科研需要；将围绕各产业发展需求，加快重点实验室科研成果向生产力转化，提高微生物资源的应用价值。