枯草芽孢杆菌对鱼类气单胞菌的拮抗作用

闫子豪 , 刘 洋 , 李月红,2

(1. 吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林 长春 130118 ； 2. 动物生产及产品质量安全省部共建教育部重点实验室 ， 吉林 长春 130118)

益生菌可以改善宿主体内的生态环境，减少疾病的发生，近年来成为水生动物饲喂抗生素最有潜力的替代品。枯草芽孢杆菌作为益生菌中的一大类，具有改善水体的生态环境、抑制有害菌的生长、维持和调整肠道微生态平衡、提高饲料利用率、促进动物生长、缓解重金属对鱼体肠道的影响[1]等优良特性;可以形成芽孢，在极端恶劣的条件下生存，细胞壁中不含内毒素，可以分解明胶，还原硝酸盐，水解淀粉，是水产养殖中经常使用的微生态制剂[2]。微生态制剂进入肠道后可以通过生物拮抗和争夺氧气含量抑制有害微生物的生长，拮抗作用是微生物之间普遍存在的自然现象，微生物可以通过分泌抗生素、有机酸等拮抗物质来抑制其他微生物生长。枯草芽孢杆菌能显著提高吉富罗非鱼幼体的免疫功能、抗氧化力和攻毒存活率，减少生产上的用药，有利于构建无公害养殖模式。

气单胞菌嗜温型(运动性)包括维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌、舒伯特气单胞菌和温和气单胞菌等。还有一类是嗜冷型(非运动性)气单胞菌[4]。气单胞菌是鱼类运动性气单胞菌败血症(MAS)的主要病原体，发病特征表现为身体充血和腹部膨胀。气单胞菌主要存在于淡水鱼类中，偶尔也存在于海洋鱼类中。其他水生动物，包括对虾、螃蟹、贻贝、鳗鱼和青蛙也易感，至今已经发现维氏气单胞菌的多种毒力基因，如外毒素(又称肠毒素)、气溶素、外膜蛋白、弹性蛋白酶、金属蛋白酶、各种黏附因子等[5]。气单胞菌对我国的水产养殖业的威胁越来越大，更重要的是，气单胞菌通过水和水生食物从环境传播给人类，导致近年来人类感染增加，包括急性腹泻以及皮肤和软组织感染。目前，气单胞菌作为食源性致病菌越来越受到重视[6]。

1 气单胞菌

1.1 气单胞菌的致病机理 以嗜水气单胞菌为例，它可以产生多种毒力因子。气溶素(Aerolysin)是嗜水气单胞菌的主要毒性蛋白，可以通过在细胞膜表面形成孔洞造成溶血[7]。弹性蛋白酶(Elastase)是嗜水气单胞菌产生的一种热稳定的金属蛋白酶，该蛋白酶可以水解弹性蛋白和酪蛋白，有研究证明，弹性蛋白酶可以造成鳗鱼和小鼠死亡[8]。金属蛋白酶(Metalloprotease)是一类活性依赖于金属离子的蛋白酶，可以帮助细菌入侵宿主和帮助细菌在宿主体内繁殖，并且造成实验动物死亡[9]。Suarez等[10]报道了嗜水气单胞菌SSU的6型分泌系统(T6SS)在小鼠模型中发挥了重要的毒力作用，溶血共调节蛋白(Hcp)能够被运到细胞质内，通过Caspase 3途径诱导细胞凋亡，帮助细菌逃避宿主的天然免疫，来让细菌在宿主细胞内更好地繁殖。

1.2 气单胞菌的危害 研究表明[11],由维氏气单胞菌分泌的气溶素破坏了斑马鱼的肠道屏障，促使维氏气单胞菌本身和其他气单胞菌进入到鱼的体内导致鱼死亡。我国华南地区血病暴发的主要原因是维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的联合感染，并且维氏气单胞菌是疾病暴发的先决条件。近年来，在我国发现的由于感染维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌而引发疾病的发病率呈现上升趋势，并且因为抗生素的使用，使得这些菌株耐药性和毒力也变强。Uzun等[12]在对市场购置的水产品和肉产品中分离的87株菌进行鉴定，发现维氏气单胞菌占有60%。龚倩等[13]发现，吉林某养殖场中框镜鲤细菌疾病暴发的致病菌为维氏气单胞菌。邓院生等[14]研究发现，苏州地区大部分鲫鱼出血死亡是由维氏气单胞菌导致的。Ran等[15]在2018年进行的研究显示，2009—2014年我国南方各省的鲤鱼败血症暴发是由维氏气单胞菌而非嗜水气单胞菌引起的。

2 枯草芽孢杆菌

2.1 枯草芽孢杆菌的作用机理 在水生生物中，枯草芽孢杆菌主要有2种行为方式，竞争排斥和免疫调节，通过刺激机体免疫应答，增强细胞免疫诱导动物自身免疫反应，提高自身免疫力。加入水体或者通过鱼类排便进入水体后，枯草芽孢杆菌可以去除水体中的氨氮、亚硝酸盐和沉降金属，净化水质，增加水体溶氧量，能有效地改良养殖水体，提高水生动物的整体健康水平，从而减少养殖水体污染导致的鱼类疾病和死亡[6]。枯草芽孢杆菌通常在消化道和肠道黏膜上定植，使病原菌不能黏附在肠道中，从而减少病原菌。有些益生菌通过产生有机酸，改变肠道内环境的pH，产生一些广泛的拮抗物质和抗生素化合物，抑制病原菌和其他细菌的生长。通过产生各种化合物激活动物的免疫系统，从而提高对病毒、细菌、真菌和寄生虫的抵抗能力[11]。枯草芽孢杆菌具有广谱抗菌和抗生物膜活性[16]。

2.2 枯草芽孢杆菌对气单胞菌的拮抗作用

2.2.1 体外拮抗 沈智华等[17]的研究发现，枯草芽孢杆菌对河蟹气单胞菌致病菌和鱼类细菌性败血症病原菌有抑制作用，但对甲鱼致病性气单胞菌无明显抑制作用。有研究表明，枯草芽孢杆菌对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌都具有一定的抑制作用。但对于嗜水气单胞菌只有在枯草芽孢杆菌初始接种浓度高于嗜水气单胞菌的初始接种浓度时才能发挥抑制作用，对于不同病原菌引发的水产养殖动物疾病要挑选不同的治疗方案[18]。杨丽莉等[19]的研究表明，枯草芽孢杆菌产生的抗菌脂肽可以增加嗜水气单胞菌的细胞膜通透性，造成细菌渗透压失衡和胞内物质泄漏，最终引起细菌死亡。任雨薇[20]通过共同培养枯草芽孢菌和嗜水气单胞菌，发现枯草芽孢杆菌可以抑制嗜水气单胞菌的多个毒力基因的表达，包括气溶素aer、弹性蛋白酶ahyB、溶血共调解蛋白hcp、金属蛋白酶emp以及其他群体感应luxS基因表达;此外，还证明当luxS表达下降，嗜水气单胞菌的毒力因子表达也下降，可能是由于枯草芽孢杆菌产生了某种化合物能够干扰嗜水气单胞菌的群体感应系统。在王娜[21]的研究中，把嗜水气单胞菌J-1的luxS基因敲除，结果显示该菌的毒力基因aer、ahe、emp和hcp等表达量也出现了下降的现象。体外的拮抗作用是枯草芽孢杆菌的首选筛选方式，不同来源、不同群落的枯草芽孢杆菌对气单胞菌的拮抗效果也不同。

2.2.2 体内拮抗 早在1986年Kozasa[22]首次将益生菌用于水产养殖中，因其降低了爱德华氏菌引起的日本鳗鲡鱼苗死亡，此后益生菌特别是芽孢杆菌受到了水生生物学家们的注意，在水生动物上的研究和应用得到了迅速发展。Kong等[23]研究了口服芽孢杆菌对嗜水气单胞菌引起的草鱼肠道黏膜屏障功能损害和炎症的影响，结果表明，枯草芽孢杆菌可以保护肠道绒毛的完整性和紧密的连接结构，减少嗜水气单胞菌诱导的肠黏膜屏障功能损坏和炎症。Tang等[24]通过在饲料中添加枯草芽孢杆菌并测定嗜水气单胞菌对草鱼的氧化应激损伤，结果表明，枯草芽孢杆菌可以为鱼类提供有效的保护，使鱼体免受嗜水气单胞菌感染引起的氧化应激损害。Hao等[25]在草鱼日粮中添加了枯草芽孢杆菌，然后对草鱼肠道中的菌群进行16S rDNA基因序列比较，结果证明枯草芽孢杆菌可以积极改善草鱼肠道内微生物群落的组成，这与调节草鱼的免疫力有关，可能会降低草鱼养殖期间疾病暴发的风险。Banerjee等[26]评估了从鱼胃肠道分离的枯草芽孢杆菌LR1的益生菌潜力，包括拮抗活性、酶产生、溶血活性、生物安全性、抗生素敏感性和胆汁耐受水平，结果显示LR1对分歧杆菌和鲑鱼气单胞菌等致病菌的活性有抑制作用，并且可以有效降低印度主要鲤鱼的细菌致病性。Newaj等[27]的研究也证明了通过饲喂从鱼肠获得的枯草芽孢杆菌可以有效控制鱼致病性气单胞菌感染。还有研究使用富含枯草芽孢杆菌的卤虫饲喂观赏鱼(玛丽鱼)，结果表明在枯草芽孢杆菌饲养卤虫浓度为1×105CFU/mL条件下可以改善肠道菌群和对嗜水气单胞菌的抗性[28]。展胜[29]通过对鲫鱼饲喂含有B.velezensisC-11和S-22的鱼粮2周，空腹1 d后进行维氏气单胞菌攻毒试验，通过对照肠道绒毛发现饲喂枯草芽孢杆菌的肠道绒毛基本完好无损，同时其可刺激鲫鱼机体免疫，提高鲫鱼的抗病力。大量的试验都证明了枯草芽孢杆菌在渔业发展中的诸多益处，如改善水体生态环境，提高鱼体免疫力，对致病菌的拮抗作用等，其能很大程度的提高鱼类存活率，提升鱼类生长效率，增加经济效益。

3 展望

枯草芽孢杆菌具有改善水质、增加宿主的生长、改善肠道菌群、对病原菌的拮抗等优良特性，使其作为益生菌在众多农业领域中得到广泛应用。近年来，越来越多的研究者选择了枯草芽孢杆菌作为生物制剂，但是对于枯草芽孢杆菌的研究还需要进行更加细致和深入的研究，包括对病原菌拮抗作用的机制，枯草芽孢杆菌在鱼肠道的定植机理，是否与其他益生菌或药物产生拮抗作用进而对肠道菌群有消极的影响，对于不同生长阶段鱼类的作用效率以及枯草芽孢杆菌的产品开发及应用问题等，同时对于枯草芽孢杆菌群体感应系统的研究也具有巨大的潜力。