基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术在病原微生物鉴定中的应用

张浩然 ， 孙冰清 ， 徐 汀 ， 黄家莺 ， 张亦菲 ，田 恺 ， 华贤辉 ， 孟 和

(1. 上海交通大学农业与生物学院 上海市兽医生物技术重点实验室 ， 上海 闵行 200240 ； 2. 上海市动物疫病预防控制中心 ， 上海 长宁 201103)

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术最早由田中耕一于1987年提出[1-2]，之后逐渐发展并应用于病原微生物的鉴定[3]。MALDI-TOF MS技术凭借其简单快速、高效准确等优点[4]，已广泛应用于食品[5]、水产[6]、人类及兽医临床[7-8]等多个领域的病原微生物鉴定工作，在细菌、真菌和病毒鉴定方面，展现了巨大的应用潜力[9]。

本文从细菌、真菌、病毒三方面综述了MALDI-TOF MS技术鉴定病原微生物的研究进展，探讨了该技术的优势和不足，并给出其发展建议。

1 MALDI-TOF MS的基本原理

MALDI-TOF MS主要包含5个模块，分别是进样模块、离子源、质量分析器、检测器和数据处理模块。其中MALDI是离子源，TOF MS是飞行时间质量分析器，两者是MALDI-TOF MS技术的关键部分。

MALDI的主要原理是首先将病原微生物样品分散在水、甲醇或乙醇等基质中，形成共晶体膜。然后，利用某一波长的激光对共晶体膜进行照射，基质吸收能量后，将其传递给样品，从而令样品在瞬间蒸发解吸达到离子化的目的[10-13]。TOF MS的主要原理是离子在电场作用下进入飞行管道，由于测定离子的质荷比不同，其在通过管道到达检测器的飞行时间也不同，从而达到检测离子的目的[14-15]。利用质荷比和信号强度得到质谱图，再通过数据处理模块分析，得到待测病原微生物样品蛋白的特异性指纹图谱，并将其与数据库中的参考图谱进行对比，从而得到鉴定结果并由此达到病原微生物鉴定的目的[16-17]。

2 MALDI-TOF MS技术在病原微生物鉴定方面的应用

2.1 对细菌的鉴定

2.1.1 对革兰阴性菌的鉴定 大肠埃希菌为动物和人类临床常见的病原微生物，致病性大肠埃希菌会导致新生儿败血症、影响畜禽和鱼类生长繁殖，严重威胁人类和动物健康[18-19]。但是，许多国家标准的细菌鉴定方法以生化鉴定为主，其用时长、操作繁琐，因此部分学者开始寻求新的革兰阴性菌鉴定技术。

高芸等[20]采用MALDI-TOF MS技术完成了对猪肠道菌群中的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌等的鉴定，并对mcr-1阳性菌株进行了分型研究，发现了mcr-1在猪肠道菌群中克隆传播的现象及水平传播的可能，并且肯定了MALDI-TOF MS技术在细菌鉴定及分型研究中的技术优势。此外，为探究MALDI-TOF MS技术在革兰阴性菌鉴定方面的可靠性，王旭晖等[21]将MALDI-TOF MS和VITEK-2全自动微生物鉴定2种技术进行比较，对临床分离得到的120株常见革兰阴性菌进行鉴定，差异结果采用16S rDNA测序验证。结果显示，115株细菌的鉴定结果相符合，5株不符合，符合率达到95.83%；通过对5株差异菌株进行16S rDNA测序，发现有2株测序结果与VITEK-2鉴定结果一致，3株测序结果与MALDI-TOF MS鉴定结果一致。由此表明，MALDI-TOF MS技术在常见革兰阴性菌鉴定及分型检测方面均具有较高的准确性，有助于实验室人员的日常高通量检测任务。

2.1.2 对革兰阳性菌的鉴定 如今，饲料减抗是畜牧业的大势所趋。因此，作为抗生素的代替品，益生菌类制剂逐渐被畜禽养殖业所关注[22]。根据《饲料添加剂品种目录(2013)》规定，粪肠球菌、屎肠球菌作为抗逆性较强的益生菌，被允许在饲料中使用。但是，作为机会致病菌，肠球菌也会引起人和动物的多种感染[23]，因此，需要建立快速鉴别粪肠球菌、屎肠球菌等革兰阳性菌的方法，以规范饲料添加剂市场，从而保障人和动物食品安全。

马艳宁等[24]利用MALDI-TOF MS技术对2013年1月—2014年9月间临床分离的革兰阳性菌进行确认，共鉴定出革兰阳性球菌3 812株，分别为2 094株葡萄球菌属共18种、1 254株肠球菌属共10种、374株链球菌属共19种以及90株其他革兰阳性球菌9个属，通过鉴定还发现了常规鉴定方法不能鉴定出的罕见菌种及其亚种。该研究表明，MALDI-TOF MS技术能够快速准确地鉴定临床常见的革兰阳性球菌，并且在罕见菌种鉴定方面具有明显优势。此外，王海花等[25]用16S rRNA测序结果分析了MALDI-TOF MS技术和VITEK-2技术鉴定革兰氏阳性菌的准确性。根据16S rRNA测序结果，33株猪源性肠球菌分别为10株粪肠球菌和23株屎肠球菌。相较之下，VITEK-2技术仅有26株细菌被鉴定至种的水平，其中粪肠球菌8株，屎肠球菌0株，铅黄肠球菌18株，与测序结果的一致性较低，为21%(7/33)；利用MALDI-TOF MS技术33株细菌全部被鉴定至种的水平，其中粪肠球菌13株，屎肠球菌20株，与测序结果的一致性较高，为88%(29/33)。该研究表明，对于肠球菌的检定，MALDI-TOF MS技术比VITEK-2技术更具优势。

另有研究表明[26]，动物源性屎肠球菌会因为传代次数不同而发生变化，从而影响VITEK-2技术的鉴定结果，这与王海花等[25]的研究结果一致，也进一步解释了VITEK-2技术在鉴定屎肠球菌方面存在的不足，而MALDI-TOF MS技术存在优势。

2.2 对真菌的鉴定 真菌又名霉菌毒素。饲料被真菌污染后适口性变差，导致畜禽采食量下降从而影响其生长[27]，还会降低畜禽的繁殖性能甚至损害其肝脏、肾脏等器官[28]。此外，霉菌毒素会在肉、蛋、奶等动物源性食品中富集，威胁人类健康[29]。国际上NHI、Bruker Daltonik等机构相继建立了质谱数据库并利用MALDI-TOF MS技术取得了90%以上的鉴定准确率[30-31]。Mcmullen等[32]采用MALDI-TOF MS技术对144株曲霉菌进行了鉴定，鉴定至种水平的有133株，占93.6%，并且能够将形态学鉴定为属水平的13株菌进一步鉴定至种。张伟铮等[33]采用MALDI-TOF MS技术鉴定了254株丝状真菌，并以测序技术对鉴定结果进行验证，总体符合率为83.97%，其中，毛癣菌属、毛孢子菌属和毛霉菌属符合率为100%，曲霉菌属符合率为96.5%，并且形态学难以区分的真菌也能够得到鉴定。

真菌鉴定常用的方法有形态学鉴定和分子生物学鉴定。其中形态学鉴定具有主观因素，并且很多菌落形态在镜检时难以判断，而分子生物学鉴定对实验室及操作人员的要求较高且操作复杂，不利于大量样品的鉴定工作[34]。MALDI-TOF MS技术在真菌鉴定方面准确高效，并且随着质谱数据库的不断更新，其鉴定结果的准确性会进一步提高。

2.3 对病毒的鉴定 虽然MALDI-TOF MS技术主要应用于细菌鉴定，但已有部分研究人员将该技术应用于鉴定病毒的研究中，并且取得了良好进展[35]。万敏等[36]比较了MALDI-TOF MS技术和表面等离子谐振技术(SPR)对人乳头瘤病毒(HPV)的鉴定，发现2种技术对国家参考品的检测结果一致。利用测序技术鉴别了93份阳性样本(高危型77份)和36份阴性样本;MALDI-TOF MS技术鉴定阳性样本82份，阴性样本32份，分型灵敏性为88.2%(82/93)，特异性为88.9%(32/36)，对高危型样本的分型准确率为100%(77/77)，说明MALDI-TOF MS技术能够较好地应用于病毒鉴定。

3 MALDI-TOF MS技术的优势与不足

3.1 MALDI-TOF MS技术的优势 目前多数病原微生物鉴定以生化和形态鉴定为主，其成本低且对设备需求不高，但是普遍存在效率低下、准确性欠佳等问题，难以满足时效性及高通量作业的要求[37-38]。分子生物学鉴定(如16S rDNA技术)的结果可靠，但其检测成本和操作门槛较高，推广起来存在诸多限制[39-40]。MALDI-TOF MS技术在病原微生物鉴定方面具有高效、稳定、准确、检测价格低廉等优势[38]，有望成为替代传统生化鉴定和分子生物学鉴定的新技术。

3.2 MALDI-TOF MS技术的不足 MALDI-TOF MS技术最大的局限性在于数据库。MALDI-TOF MS在鉴定时需要进行数据库匹配，难以识别没有添加到数据库中的病原微生物[41]。国际上一些机构已着手建立数据库[30-31]，国内的数据库建立工作也已经起步。鲍春梅等[42]在国际上首次建立了宋内志贺菌质谱数据库，并利用MALDI-TOF MS技术分别分析了直接涂抹法及提取法对50株宋内志贺菌的鉴定情况，其中，提取法处理的鉴定结果符合率为100%，直接涂抹法处理的鉴定结果符合率为60%。该结果说明，数据库的建立为MALDI-TOF MS技术的长久发展提供了保障，但不同的前处理方式会干扰鉴定结果。

不仅如此，有研究指出，病原微生物的培养时间[43]、培养基的选择[44]也会影响鉴定结果。目前，国内部分数据库图谱直接引自国外，那么国内外地域环境的差异、实验室间病原微生物培养方式的差异等，都对数据库图谱造成影响，从而干扰鉴定结果[45]。由此引出另一个问题，即缺乏一套标准化的流程。这会使各实验室操作人员对于MALDI-TOF MS的参数设置、待鉴定病原微生物的培养条件、试验的前处理方式难以统一，对MALDI-TOF MS技术从新兴走向成熟提出了挑战。

4 MALDI-TOF MS技术的发展方向

4.1 建立数据共享平台 数据库看似制约了MALDI-TOF MS技术的发展，实则是该技术拥有无限潜力的有力保证。目前各大品牌的数据库均支持用户自我添加，并且会定期进行更新。此外，随着各领域研究的不断深入，越来越多的本土化标准图谱会进一步完善数据库内容[46-48]，从而逐渐避免因国内外地域差异和试验操作差异对鉴定结果的影响。因此，目前的首要任务是建立一个完善的数据共享机制，在确保数据科学准确的前提下，让每个实验室都能分享各自的标准图谱，共同打造一个本土化的数据共享平台，这将是MALDI-TOF MS技术未来的发展方向。

4.2 推行MALDI-TOF MS技术的标准化 国家标准《基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则》(GB/T 33682—2017)的出台推进了MALDI-TOF MS技术标准化工作的进程。但是，除了顶层的通则标准，还需要在细节上制定相应的方法标准，针对不同病原微生物建立相应的培养、前处理标准流程，建立统一的评判标准等，从而对仪器的规范操作、质控手段、鉴定流程、报告格式等多方面进行统一规范。当然，随着MALDI-TOF MS技术的广泛应用，数据库的建库标准也必将提上日程。因此，一整套科学规范的标准化体系将是MALDI-TOF MS技术的走向成熟的关键。