一例隆林山羊败血症的诊断与治疗

李佳荣，李鹏举，陈海兰，韦英明，潘 艳

（1.广西百色农业学校，广西 百色 533000；2.广西大学，a.动物科学技术学院；b.农牧产业发展研究院，南宁 530004；3.广西农业职业技术大学，南宁 530007）

细菌混合感染引起的出血性肠炎、纤维素性肺炎是养殖山羊中经常发生的疾病。细菌混合感染的复杂性使疾病的诊断与预防颇为棘手。通过实验室鉴定结合临床症状综合分析，才能确定主要导致血性肠炎、纤维素性肺炎的病菌，然后通过药物筛选进行合理治疗。大多数山羊细菌混合感染与养殖条件及疾病预防有紧密联系，因此，改善养殖环境、满足羊群营养需求、加强免疫力才是预防和控制疾病的有力措施。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 广西某隆林山羊养殖场突然病死的山羊，剖解后取出心、肝、脾、肺、肾、十二指肠送至实验室检测。

1.1.2 试剂 病毒DNA/RNA提取试剂盒、100 bp Ladder、2×EsTaqMaster Mix（Dye）、ddH2O均购自北京康为世纪生物科技有限公司；革兰氏染色试剂盒、伊红美蓝琼脂培养基、LB营养肉汤固体培养基、LB营养肉汤液体培养基、哥伦比亚血平板等均购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.1.3 引物设计与合成PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于检测绵羊肺炎支原体（MO2）、丝状支原体山羊亚种（MMMLC2）、多杀性巴氏杆菌A型（PMA）与多杀巴氏杆菌D型（PMD）、溶血曼氏杆菌（MH）、隐秘杆菌（AP）、16S rDNA通用引物。引物如表1所示。

表1 PCR扩增引物

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 用点燃的酒精棉球在各内脏取样点表层消毒灭菌，选取病变较为明显的部位剪开，用无菌接种环蘸取病变组织部位划线于伊红美蓝琼脂培养基、哥伦比亚血平板和LB营养肉汤固体培养基上，培养24 h［1］。

1.2.2 细菌的分离 用平板划线法挑取单个菌落，反复挑取6～8次［2］，革兰氏染色镜检，挑取较为纯净单一的菌种进行分子鉴定。

1.2.3 病料DNA/RNA的提取 将肺脏的病变部位剪取小部分，置于无菌研钵中，加入1 mL双蒸水进行研磨，直至组织样品破碎，然后将研磨好的组织样品装入2 mL EP管中，反复冻融3次，使病菌细胞破裂，通过DNA/RNA提取试剂盒提取细菌DNA/RNA［3］，置于-20℃备用。

1.2.4 单一细菌DNA/RNA的提取 于1.5 mL离心管中加入0.3 mL双蒸水，挑取已经分离纯化的单个菌落于离心管中，按照细菌基因组提取试剂盒中操作步骤提取。

1.2.5 PCR鉴定 参考国家标准GB/T19915.4—2000，对样品进行PCR鉴定。PCR反应体系：2×EsTaqMaster Mix（Dye）25 μL，上、下游引物各2 μL，样品6 μL，补ddH2O至50 μL。PCR扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s（退火温度参考各引物的退火温度，见表1），72℃延伸1 min，30个循环；72 min延伸4 min；4℃保存［4］。取10 μL PCR产物加入到1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，通过凝胶成像系统观察分析。

1.2.6 病菌的K-B药敏试验 利用无菌接种环挑取单个菌落于灭菌的生理盐水中，制备成0.5麦氏单位的菌悬液，然后用无菌的棉拭子蘸取菌悬液均匀涂布于血平板上，将药敏纸片贴在平板内，37℃培养24 h，观察并测量抑菌环的直径并记录［5］。

1.2.7 16S rDNA测序结果分析 由于采用二代测序技术，每次只能获取800 bp碱基序列，因此，测序时将16S区进行分开读取，即前端加标记物、引物和v1～v4区的片段，而后段采用逆向测序。在比对分析时要取出前后两端的标记物和引物，连接16S区，然后在数据库中进行比对。

1）16S区的拼接。在DNAman软件中Sequence选项下选择Sequence Assembly，然后Add file添加seq文件的27F前端与1492R后段，之后点击Assemble，若显示有重叠区，则表示可以进行拼接，再选择show result，最后Export在txt文本中备用［6］。而大多数16S区经过拼接基本上稳定在1 410～14 850 bp。结果中出现双峰，则表示分离到的细菌不是单一菌种，需要进一步进行纯化分离，然后继续进行测序。

2）拼接序列的比对。打开NCBI数据库中BLAST下的nucleotide blast进行选择，然后复制拼接好的文本文件中的碱基序列于数据库中，同时以Standard databases数 据 库 和rRNA/ITS databases两个数据库中的比对结果共同参考，若两个数据库中相同菌种的相似度均>99%，则认为测序菌种和比对的菌种为同一菌种；若相似度在98%～99%，则认为测序菌种有50%的概率和比对的菌种为同一菌种；若相似度在97%～98%，则认为测序菌种有20%的概率和比对的菌种为同一菌种；若相似度在95%～97%，则认为测序菌种为新的种；若相似度<95%，则认为测序菌种为新的属，可进一步进行新的细菌鉴定［7］。

2 结果与分析

2.1 临床病理变化

对内脏解剖观察发现肺脏出血、尖叶黏连；肝脏出血，有坏死灶；肠道出血，有恶臭味；肾脏有出血斑点；脾脏肿大呈现血黑色。

2.2 细菌的分离

在伊红美蓝琼脂培养基上观察到深紫黑色、光滑、带有金属光泽的圆形菌落。革兰氏染色镜检，呈两端顿圆、粉红色杆状的形态，结合临床症状判断为致病性大肠杆菌［8］。而在血平板培养基和LB营养肉汤培养基上分离到5株纯化的细菌，经过16S rDNA鉴定分别为大肠杆菌、多杀巴氏杆菌、印度不动杆菌、豚鼠气单胞菌、科氏葡萄球菌。其中大肠杆菌与伊红美蓝平板中的鉴定结果一致，而多杀巴氏杆菌与PCR鉴定结果一致，这些细菌均会导致内脏出血而引起动物发病，与临床症状相吻合。

2.3 革兰氏染色结果

对分离纯化的细菌进行革兰氏染色，判定其基本的外形特征，革兰氏染色结果如图1所示。

图1 5种细菌的革兰氏染色结果

2.4 PCR鉴定结果

对研磨样品进行PCR鉴定，被检测样品中只有多杀巴氏杆菌D型出现了657 bp的条带，其他样品均无条带，该羊感染的是多杀性巴氏杆菌D型（表2）。

表2 样品PCR鉴定结果

2.5 系统发育树

将16S碱基序列经过DNAman软件拼接，再在NCBI数据库中比对，选择相似度大于97%的菌株16S序列；最后使用MEGA-X软件绘制系统发育树，经过Neighbor-Joining算法对碱基序列进行逐一比对，绘制系统发育树。当待鉴定菌种与相似菌种在同一个枝干上时，则表示待鉴定菌种为该菌种，从而确定待鉴定菌种［9］。系统发育树结果如图2所示。

图2 5种细菌的16S系统发育树

2.6 药敏试验结果

选择22种药敏试纸片进行药敏试验，结果如表3所示。混合细菌对罗红霉素、利福平、青霉素、四环素、林可霉素、诺氟沙星、强力霉素、环丙沙星、链霉素、氨苄西林、复方新诺明、阿奇霉素不敏感；对头孢曲松、阿米卡星、氧氟沙星、恩诺沙星、头孢他啶、多粘菌素中度敏感；而对头孢噻肟、替米考星、卡那霉素、氟苯尼考高度敏感。

表3 药敏试验结果

2.7 防治措施

隔离患病羊只是关键，防止疾病的蔓延，便于精准化用药治疗。具体治疗措施如下：①替米考星注射液0.04 mL/kg，皮下或肌肉注射，每天1次，连用5 d；②青霉素钠与恩若沙星注射液液混合0.1 mL/kg，肌肉注射，每天2次，连用5 d。2种治疗方案交替使用可以防止混合菌产生抗药性，更有利于杀灭细菌［10］。

3 讨论

3.1 5株分离菌株的鉴定

大肠杆菌广泛存在消化道内，只有少数为致病性大肠杆菌，因此分子鉴定可以鉴定到亚种水平，再通过临床特征上山羊腹泻症状，因此确定为致病性大肠杆菌；而通过多杀性巴氏杆菌的特定性引物、16S测序以及多器官有出血及出血点等综合判断为多杀性巴氏杆菌［11］；印度不动杆菌在血平板上生长时为乳白色，表面光滑不透明，且容易产生难闻气味，该菌株广泛存在于垃圾堆，而临床剖解中也发现内脏中产生腐败的气味，因此综合判断为印度不动杆菌［12］；豚鼠气单胞菌可引起动物腹泻，因此分离出菌株与临床症状相符合［13］；而科氏葡萄球菌菌落不透明、乳白色、菌落表面光滑、兼性厌氧、革兰氏阳性球菌，血平板培养有溶血环，易引起体温升高、炎症以及败血症等，且会导致动物的急性死亡。这也与临床症状相符合，因此综合判定为科氏葡萄球菌［14］。

3.2 饲料配方的调整与优化

通过对该养殖场饲料检测，发现该养殖场中30 kg体重成年育肥公羊的营养不合理，从而导致羊群的营养不均一、未能达到该阶段羊群的需要量，造成免疫力低下，养殖成本居高不下，因此需要重新制定全混合饲料。

4 小结

高温高湿容易引起病菌的滋生与蔓延，同时空气流动性较差，加速传染性疾病的传播，因此做好环境杀菌与羊群抽检十分必要，可为精准化治疗与防疫提供可靠的依据，避免盲目用药，提高养殖效益。同时改善饲养环境，随时根据羊群的生长阶段改变饲料配方，使羊群营养处于达标水平，从源头上控制预防疾病。