生慧汤对APP/PS1雄性AD小鼠海马内APP代谢产物的昼夜变化影响＊

文 纯，游秋云，王 平，丁 莉＊＊

（1.湖北中医药大学药学院 武汉 430065；2.湖北中医药大学老年医学研究所 武汉 430065）

据报道[1]，阿尔兹海默病(Alzheimer Disease,AD)在我国65岁以上老年人群中发病率为5%。而随着中国社会人口结构迈入老龄化，老年人口基数的增大，预估2030年我国AD患者数量接近1500万，其治疗将会给社会带来沉重负担。目前研究认为[2]，可溶性β淀粉样蛋白(Amyloid beta-Peptides,Aβ)的脑内水平变化与AD发病密切相关，而可溶性β淀粉样蛋白主要是由淀粉样前体蛋白(Amyloid beta-Protein Precursor，APP)的淀粉样蛋白代谢途径生成，早老蛋白基因1(Presenilin-1，PS1)是APP代谢过程中γ分泌酶的亚单位，PS1基因发生突变，会特异性地促进Aβ1-42的形成[3]。因此，研究APP代谢产物显得尤为重要。课题组前期研究发现[4-6]，APP/PS1双转基因小鼠在5月龄时，白天活动时间增加、休息减少，丧失昼伏特性，白昼与黑夜的活动时间不具有昼夜差异性。这并不符合啮齿类动物昼伏夜出的生活习性，由此推测其自主活动节律性开始发生明显紊乱。同时也有研究表明[7]，随着白昼与黑夜之间活动规律差异缩小，会影响认知行为以及突触的可塑性。已有研究显示[8]，随着年龄增长，老年人群常发生的昼夜节律紊乱会增加AD的患病风险，这可能是由于中枢昼夜节律的紊乱会引起APP代谢紊乱，导致Aβ的异常沉积[9]，同时Aβ在脑内的代谢与昼夜节律以及学习记忆联系紧密[10,11]。APP代谢受到α、β、γ三种酶共同调控[12-14]，代谢产物包括sAPPα、sAPPβ和Aβ。根据调控APP代谢的酶不同[15]，将APP水解分为两类：一是淀粉样蛋白代谢(β、γ酶调控)，由β、γ酶对APP进行酶切水解，生成Aβ；二是非淀粉样蛋白代谢(α酶调控)，由α酶对APP进行酶切，水解后的主要产物是sAPPα。

生慧汤出自《辩证录·健忘门》，常用于治疗失眠、健忘，由熟地黄、山茱萸、远志、生枣仁、柏子仁、人参、茯神、石菖蒲以及白芥子九味中药材组成。生慧汤研究主要与睡眠及昼夜节律有关[16,17]，一是生慧汤可减轻睡眠剥夺对神经元的损伤，可能是与其调节PSD95和SYN表达及调控凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达有关；二是生慧汤能够上调节律基因Bmal1的表达，降低IL-6、TNF-α的含量，从而调节昼夜节律紊乱改善AD。而生慧汤对AD痴呆模型APP代谢产物的昼夜变化影响少有报道。

因此，本文采用生慧汤干预APP/PS1双转基因小鼠，通过酶联免疫吸附(ELISA)检测不同时间段取出的海马组织sAPPα表达水平，对海马β淀粉样蛋白1-40、β淀粉样蛋白1-42表达进行免疫印迹分析，免疫组化(IHC)检测海马CA1区Aβ1-40蛋白的表达，以此研究生慧汤对AD模型小鼠海马内APP代谢产物的昼夜变化影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

AD模型动物：5月龄SPF级雄性APP/PS1双转基因小鼠56只，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号SCXK(辽)2020-0001，对照组动物：5月龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠14只，许可证号SCXK(辽)2020-0002。饲养在湖北中医药大学老年医学研究所动物房屏障环境，允许自由摄食与饮水。

1.2 生慧汤的制备

生慧汤：由熟地黄30 g，山茱萸12 g，远志6 g，生枣仁15 g，柏子仁(去油)15 g，茯神9 g，人参9 g，石菖蒲1.5 g，白芥子6 g组成，购自湖北中医药大学药房，批号:20201201。所有药材按组方比例称取，加入称取药材总重量的8倍量水浸泡1 h，加热至沸腾开始计时，1 h后滤取药液。药渣加水重复以上操作，滤取药液。合并药液，浓缩至1.35 g/mL、2.70 g/mL，4℃保存。

1.3 试剂与仪器

一抗：GAPDH抗体；Aβ1-40抗体、Aβ1-42抗体(武汉赛培生物科技有限公司，货号：SP11457，SP11731)；二抗：羊抗兔二抗，羊抗鼠二抗(Servicebio，货号：GB21302,GB21303)；sAPPαELISA试剂盒(美国IBL公司，货号：27734)，RIPA裂 解 液、SDS-PAGE凝 胶 制 备 试 剂 盒(Servicebio，货号：G2002，G2003)。

RT-6100酶标仪(Rayto),D3024R台式高速冷冻离心机(DRAGONLAB),TSY-B脱色摇床(Servicebio),BV-2垂直电泳仪(Servicebio),DMS-2型Morris水迷宫（中国医学科学研究院药物研究所）,ZH自发活动分析系统（淮北正华生物仪器设备有限公司）。

1.4 实验分组及给药

将56只雄性APP/PS1转基因小鼠按随机数字表法分为：模型组、褪黑素组、生慧汤低剂量组、生慧汤高剂量组4组，每组14只。对照组为5月龄C57BL/6J小鼠，14只。按体表面积折算等效剂量，分别计算给药剂量，褪黑素组(0.78 mg·kg-1·d-1)、生慧汤高、低剂量组(27.0 g·kg-1·d-1、13.5 g·kg-1·d-1,等 效 剂 量 的2倍、1倍)，对照组与模型组灌胃相同体积的生理盐水，给药容量均为10 mL·kg-1，每日上午9:00灌胃，连续30天。

1.5 水迷宫实验

第27天，进行水迷宫行为学实验，预先向水池中加水至没过平台2 cm，用奶粉将水池颜色染成乳白色掩盖平台，避免小鼠因视觉而找到平台。对小鼠进行训练，90 s内小鼠未找到平台，人工引导小鼠至平台，停留15 s，训练三天，第四天(第30天)进行定位航行试验，将小鼠面向池壁放入水中，找到平台停留3 s后，系统自动停止计时，找到平台时间为上平台潜伏期，90 s内未找到平台记录为90 s。第31天进行空间探索实验，撤去平台后，将小鼠面向池壁放入水中，记录90 s内小鼠穿越原平台次数。

1.6 动物取材

连续灌胃30天后，第31天行为学实验结束后，小鼠脱颈椎处死，断头，置于铺有一张滤纸的冰袋上，用眼科剪刀小心从正中矢状位剪开0.5 cm，用镊子剥去小鼠颅骨，分离脑组织，剥离海马组织置于EP管，放入冰中，取材结束后放入-80℃冰箱保存备用。

1.7 ELISA法检测不同时间段海马中sAPPα表达水平

从-80℃冰箱中取出海马组织，称取少量，置于匀浆机匀浆，离心15 min(相对离心力为3304 g)，吸取上清液，按试剂盒说明书进行检测。

1.8 Western Blot法检测β淀粉样蛋白1-40和β淀粉样蛋白1-42

从-80℃冰箱中取出海马组织，剪碎，加入裂解液，匀浆，之后置于匀浆管中，放置冰上裂解30 min，每5 min震荡一次，12000 r/min,离心10 min，取上清液，按十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）制备试剂盒说明书制备凝胶，转膜，按抗体说明书加入一抗、二抗，凝胶图像分析系统进行分析，检测小鼠海马组织Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表达水平。

1.9 免疫组织化学法检测小鼠海马CA1区β淀粉样蛋白1-40的表达

每组4只小鼠小心取出完整全脑，全脑表面若有血残留，用生理盐水冲去表面血，放入装有固定液的标本瓶，石蜡包埋，切片，染色，拍照，观察小鼠海马CA1区Aβ1-40蛋白表达情况，并采用image j软件分析计算平均光密度，进行比较。

1.10 统计学处理

2 结果与分析

2.1 水迷宫结果

结果如图1、图2所示，与对照组相比，模型组小鼠上平台潜伏期延长，穿越平台次数减少(P＜0.01、P＜0.01)；与模型组相比，生慧汤给药组小鼠上平台潜伏期缩短，穿越平台次数增加(P＜0.01、P＜0.05)。

图1 各组小鼠上平台潜伏期(n=14)

图2 各组小鼠穿越平台次数(n=14)

2.2 生慧汤对各组小鼠海马sAPPα表达水平的影响

2.2.1 sAPPα总量比较

结果如图3所示，与对照组相比，模型组小鼠海马组织sAPPα总量减少(P＜0.01);与模型组相比，生慧汤不同剂量组小鼠海马组织中sAPPα总量增加(P＜0.01、P＜0.05)。

图3 小鼠海马组织sAPPα总量比较(pg/mL，n=10)

2.2.2 sAPPα含量昼夜差异比较

结果如图4所示，通过比较两个不同时间段（12:00与24:00）sAPPα含量，发现对照组小鼠海马内sAPPα含量具有明显昼夜差异(P＜0.01)，而模型组sAPPα含量的昼夜差异现象消失(P＞0.05)；生慧汤高剂量能够恢复sAPPα含量的昼夜差异表达(P＜0.01)。

图4 小鼠海马中sAPPα昼夜差异比较(pg/mL,n=5)

2.2.3不同时间段的sAPPα含量比较

结果如图5所示，12:00时，与对照组相比，模型组小鼠海马内sAPPα含量明显下降(P＜0.01)；与模型组相比，褪黑素组、生慧汤高剂量组sAPPα含量明显增加(P＜0.01)，生 慧 汤 低 剂 量 组sAPPα含 量 无 差 异(P＞0.05)；24:00时，与对照组相比，模型组sAPPα含量明显下降(P＜0.01)；与模型组相比，生慧汤高剂量组sAPPα含量无差异(P＞0.05)，生慧汤低剂量组sAPPα含量明显增加(P＜0.05)。（见图5）

2.3 生慧汤对海马组织β淀粉样蛋白表达水平的影响

结果如图6所示，与对照组相比，模型组小鼠海马组织Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，生慧汤高剂量组小鼠海马组织Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表达水平明显下降(P＜0.01)，生慧汤低剂量组小鼠海马组织中仅Aβ1-40蛋白表达下降(P＜0.05)，对Aβ1-42蛋白的表达影响不显著(P＞0.05)。

图6 各组小鼠海马Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表达

2.4 生慧汤对小鼠海马CA1区Aβ1-40表达的影响

与对照组相比，模型组小鼠海马CA1区中Aβ1-40表达明显增加(P＜0.01)；与模型组相比，生慧汤不同剂量组Aβ1-40表达不同程度减少(P＜0.01、P＜0.05)。

3 讨论

图7 小鼠海马CA1区Aβ1-40表达免疫组化染色图片(400×)

图8 各组海马CA1区中Aβ1-40含量差异比较(n=4)

目前，有关AD的发病机制主要分为：Aβ学说、Tau磷酸化学说、基因突变学说、炎症学说、胆碱能学说、氧化应激学说。其中，大脑内Aβ大量沉积所形成的老年斑块是AD患者最为明显的病理学特征，与此同时，研究较为关注的是Aβ与tau蛋白、炎症、胆碱能以及氧化应激之间的联系。本文从昼夜节律切入，旨在研究昼夜节律对Aβ前体蛋白APP的影响，以此探讨昼夜节律改善AD的可能机制。

3.1 sAPPα对APP代谢的影响及sAPPα的昼夜节律性

APP主要是通过非淀粉样蛋白代谢途径水解[18,19]，在sAPPα含量达到某一特定值时，会对APP的淀粉样代谢途径进行负调控，可能正是这种负调控机制，能够减少Aβ的生成，降低Aβ脑内水平，起到了保护神经元细胞作用[20,21]，发挥抗AD作用。另有研究证明[22]，随着昼夜的交替，脑内的sAPPα水平也呈现昼夜节律性变化，含量从白天到夜间呈逐渐升高趋势，觉醒状态时降低而睡眠状态时升高。而节律的紊乱可能会引起APP的代谢发生异常：APP非淀粉样蛋白代谢途径减弱，降低了sAPPα水平，并且sAPPα水平的昼夜节律性变化消失，而APP的淀粉样蛋白代谢途径则会相应增强，该代谢途径会产生可溶性Aβ肽，也就是说促进了可溶性Aβ肽的生成[23,24]，而Aβ的增加和异常沉积会引起AD的发生和加重。

3.2 结果

Morris水迷宫结果表明，生慧汤不同剂量组上平台潜伏期明显缩短，穿越平台次数明显增加。生慧汤高剂量组的sAPPα含量在全天总量、各时间段含量均明显增加，同时Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表达受到抑制。sAPPα的含量升高提示APP非淀粉样代谢活动增强，结合Aβ1-40和Aβ1-42蛋白表达受到抑制，提示痴呆症状减轻的原因，可能是随着sAPPα含量的升高，减弱了APP淀粉样代谢活动，减少了Aβ的生成。

与对照组sAPPα含量具有明显昼夜差异不同的是：在模型组中，sAPPα含量不具有昼夜差异；而褪黑素组和生慧汤组能明显增加白天(12：00)sAPPα的含量，sAPPα的含量具有明显昼夜差异，提示生慧汤组改善学习记忆可能是通过调节sAPPα含量的昼夜节律紊乱来实现。

3.3 结论

结合以上实验结果，生慧汤改善5月龄APP/PS1阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆障碍，其机制可能与恢复海马内APP代谢产物sAPPα的昼夜节律性表达、从而减少Aβ的沉积有关。

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