TTLL12 在鼻咽癌中的表达及临床意义

吴春成 连雅晨 邓世山 杨洪斌

1.川北医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，四川南充 637000；2.川北医学院解剖教研室，四川南充 637000

鼻咽癌是临床常见恶性肿瘤，具有明显的地域性。据统计，约70%的鼻咽癌病例发生在东亚及东南亚[1]。在现有诊疗模式下，鼻咽癌患者的5 年生存率大大提高，但鼻咽癌的远处转移及复发仍是制约鼻咽癌患者总体生存率的一个重要因素[2]。因此，寻找新的鼻咽癌分子标志及治疗靶点是当前研究热点。微管蛋白是肿瘤治疗的重要靶点，微管蛋白聚合并经修饰后形成微管，构成细胞骨架[3]。研究表明微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12（tubulin tyrosine ligase like 12，TTLL12）可通过干扰硝基化酪氨酸与微管的连接，减少硝基化酪氨酸微管蛋白（N-tubulin）形成，干扰人体清除异常细胞，从而促进肿瘤细胞生长[4]。有学者发现TTLL12 在肺癌、结直肠癌、前列腺癌和卵巢癌中表达明显升高，并与患者的不良预后密切相关[5-8]。本研究利用免疫组织化学法及鼻咽癌基因芯片数据分析，探讨TTLL12 在鼻咽癌组织中的临床意义及可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集川北医学院附属医院病理科2016 年1 月至2019 年12 月初治鼻咽癌患者的组织石蜡标本84 例和慢性鼻咽炎患者的组织石蜡标本28 例。所有患者均于我院喉镜下取活检，有完整的石蜡标本；鼻咽癌患者在取组织标本前均未接受任何有关鼻咽癌的治疗，并住院完成全部常规标准治疗，且临床病历资料完整。所有患者均已签署知情同意书。

1.2 研究方法及结果判定

将石蜡标本按照免疫组织化学Super Vision二步法检测组织中TTLL12 的表达。采用染色强度与阳性细胞百分比的乘积进行半定量分析染色结果。染色强度计分：无着色计0 分，着浅棕色计1 分，着棕色计2 分，着深棕色计3 分；阳性细胞百分比计分：≤5%计0 分，6%～25%计1 分，26%～50%计2 分，51%～75%计3 分，＞75%计4 分；总分为染色强度与阳性细胞百分比的乘积：0～1 分为阴性，2～4 分为+，5～8 分为++，9～12 分为+++，并定义≤4 分为低表达，＞4 分为高表达。

1.3 基因芯片数据分析

从GEO（Gene Expression Omnibus）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中筛选合适的基因芯片数据集GSE102349。GSE102349 中包含113例未分化鼻咽癌样本。使用R 4.1.1 软件绘制箱式图，分析不同临床分期中TTLL12 基因在转录水平上的表达差异。Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，分析TTLL12 与鼻咽癌患者无进展生存的相关性。

1.4 基因富集分析

对GSE102349 芯片行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，使用R 4.1.1 软件筛选差异基因。

1.5 统计学方法

应用SPSS 22.0 软件对实验数据进行统计学分析，计数资料采用例数（百分率）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法，多因素分析用Cox 回归模型分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TTLL12 在鼻咽癌组织中的表达

TTLL12 主要定位于细胞质，细胞质含棕色或深棕色颗粒定义为高表达，见图1、图2。鼻咽癌组织TTLL12 高表达57 例，低表达27 例；鼻咽慢性炎症组织TTLL12 高表达3 例，低表达25 例。与鼻咽慢性炎症组织相比，TTLL12 蛋白在鼻咽癌组织中的表达显著上调（P＜0.001）。

图1 TTLL12 在鼻咽慢性炎症组织中低表达，细胞排列规则有序，细胞质无着色或着浅黄色（SP×400）

图2 TTLL12 在鼻咽癌组织中高表达，细胞排列紊乱、异形、大小不一，细胞质呈棕色或深棕色（SP×400）

2.2 鼻咽癌患者不同临床病理特征与TTLL12表达的关系

TTLL12 高表达鼻咽癌患者的T3～T4、N2～N3、Ⅲ～Ⅳ期的占比显著高于 TTLL12 低表达患者（P＜0.05），但TTLL12 表达在不同年龄、性别、M分期的鼻咽癌患者中比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 鼻咽癌患者不同临床病理特征与TTLL12 表达的关系（例）

2.3 TTLL12 表达与鼻咽癌患者预后的关系

截至随访终点，鼻咽癌患者死亡18 例，其中高表达组16 例，低表达组2 例，高表达组患者的总生存显著低于低表达组（P=0.027），见图3。进一步行Cox 回归模型分析发现，TTLL12 高表达和N 分期均是影响鼻咽癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05），见表2。

表2 Cox 回归模型分析影响鼻咽癌患者的预后因素

图3 鼻咽癌患者Kaplan-Meier 生存曲线

2.4 TTLL12 在基因芯片数据集中的表达情况

在基因芯片数据集 GSE102349 中，TTLL12 mRNA 的表达水平与临床分期呈正相关，分期越晚，TTLL12 mRNA 的表达越高（P=0.033），见图4；TTLL12 高表达的鼻咽癌患者无进展生存率显著低于TTLL12 低表达患者（P=0.041），见图5。

图4 不同临床分期的鼻咽癌患者的TTLL12 mRNA 表达差异散点图

图5 不同TTLL12表达水平鼻咽癌患者的无进展生存曲线

2.5 功能基因富集分析

KEGG 富集分析结果提示，TTLL12 高表达基因样本主要富集在趋化因子信号通路，与人类T 细胞白血病病毒1 型感染及EB 病毒感染密切相关，见图6。

图6 KEGG 富集分析

3 讨论

微管活动异常可能引起染色体功能和结构的错误，从而导致染色体不稳定[9]。研究表明，染色体不稳定可导致细胞内变异，促进细胞表型向恶性特征转变[10]。TTLL 家族为微管蛋白相关蛋白，可调节微管蛋白或微管活性[11]。研究发现TTLL 家族与肿瘤异常表达和癌症进展密切相关[12]。

本研究中，利用免疫组织化学分析TTLL12 的表达情况，证实TTLL12 在鼻咽癌组织中表达上调，提示TTLL12 可通过某种细胞代谢途径参与促进鼻咽癌发病过程。研究发现TTLL12 表达越高的患者T、N 及临床分期越晚，且Cox 回归模型显示TTLL12 高表达和N分期均是影响鼻咽癌患者总生存的独立危险因素。提示TTLL12 作为潜在的原癌基因，参与鼻咽癌的发生发展，表明 TTLL12可作为一个潜在的基因靶点用于鼻咽癌患者预后预测及治疗。

本研究利用GEO 数据库中的数据集，分析TTLL12 在不同鼻咽癌患者中的mRNA 水平表达差异，结果显示TTLL12 在临床分期越晚的鼻咽癌患者中表达越高，与本研究结果相符。TTLL12 表达水平与鼻咽癌患者无进展生存明显相关。KEGG 富集分析结果显示TTLL12 基因主要富集在趋化因子信号通路，与人类T 细胞白血病病毒1 型感染及EB病毒感染密切相关。趋化因子信号可导致靶基因转录，参与细胞的侵袭、运动、与细胞外基质的相互作用。人类癌症有一个复杂的趋化因子网络，影响肿瘤浸润的程度和表型及肿瘤的生长、生存、侵袭和肿瘤内血管生成[13]。由此猜测，TTLL12 基因在鼻咽癌患者中可能通过促进趋化因子的表达，从而促进鼻咽癌生长及转移。肿瘤可在病毒感染后发生发展，病毒感染除引起慢性炎症外，还可通过炎症相关机制抑制抑癌基因，避免感染细胞凋亡，从而有利于病毒的潜伏、宿主细胞的增殖和持续感染[14]。越来越多的证据表明人类T 细胞白血病病毒1 型和EB 病毒的持续感染与成人T 细胞白血病和鼻咽癌的发生发展密切相关[15]。TTLL12 可能是这些病毒激活的一种促癌产物，参与肿瘤的发生发展。

综上，TTLL12 在鼻咽癌中是一个重要的原癌基因，其蛋白表达上调在鼻咽癌发生发展中发挥重要作用，且是影响鼻咽癌患者预后的独立危险因素。