模式识别受体PRRs在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征发病机制中的作用研究进展①

刁一芮 丁奇 史渊源

（北京中医药大学，北京 100029）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘 迫 综 合 征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是继发于肺内或全身的炎症反应过程，由肺泡损伤导致并形成炎症性非心源性的肺水肿。该综合征表现为急性低氧血症，胸部显像显示双侧肺浸润，并不完全由心力衰竭引起［1］。其有多种病因如败血症，细菌性肺炎，胃内容物的吸入以及流行病毒等，例如H1N1和SARS，常导致爆发性呼吸衰竭和死亡［2］。如SARS-CoV和流感病毒感染所见，病原体诱发的肺损伤可发展为ALI/ARDS，ARDS是感染SARS-CoV或MERS-CoV患者死亡的主要原因［3-4］。2019年11月，中国湖北武汉出现新型冠状病毒SARS-CoV-2，其感染常导致致死性炎症反应和ALI，其炎症机制可能与病毒快速复制、细胞损伤、ACE2和抗病毒中和抗体（anti-S protein-neutralizing antibodies，anti-S-IgG）有关［5-6］。在过去20年中，ARDS的病死率一直保持在40%左右。目前以支持治疗为主，重点是治疗基础疾病和床边护理，包括机械通气以及许多临床试验中使用的药物，如外源性表面活性物质、皮质类固醇以及β2受体激活物和他汀类药物［7］。ARDS机制研究主要集中潜在生物标志物，如促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18中［8］。柏林定义（Berlin definition）是目前医学界共识的诊断标准，在低氧血症的基础上，ARDS轻度（动脉血氧分压与吸入氧气之比200 mmHg

模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）是天然免疫系统中第一道防线的重要组成，在ALI/ARDS先天和适应性免疫反应中起着关键作用［8］。PRRs激活先天免疫并调节后天免疫对感染和非感染免疫组织损伤，可促进全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。PRRs包括Toll样受体，NOD样 受 体和RIGI样受体［11］。PRRs可识别两类配体，病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），是从坏死或垂死细胞释放的内源性分子［8，12］。TNF-α、IL-1β和IL-18等促炎因子的释放依赖于PRRs启动炎症信号级联反应，刺激自噬或细胞凋亡并诱导产生抗菌分子［8，12］。PRRs与PAMPs或DAMPs之间的相互作用导致转录因子的激活，上调炎症反应相关基因的转录，这些基因编码促炎细胞因子、趋化因子以及参与PRRs信号调节的蛋白等［11，13］。PAMPs包含细菌细胞壁成分，如脂多糖（LPS）、细菌DNA序列、病毒RNA等。DAMPs包括热激蛋白（heat shock proteins，HSP）、纤维蛋白原、透明质酸以及高迁移率蛋白1（high mobility group box-1，HMGB-1）等［11］。

1 PRRs的种类

肺泡上皮由肺泡Ⅰ型细胞和Ⅱ型细胞构成，大约95%的肺内表面由Ⅰ型肺泡细胞构建，两种细胞类型通过其基底膜融合到内皮细胞中，共同形成气体交换屏障。Ⅱ型肺泡细胞履行许多已知的功能，包括肺表面活性物质系统、肺泡液含量以及对损伤的Ⅰ型细胞替代具有重要作用［14］。Ⅱ型肺泡细胞和TLRs结合诱导趋化因子将免疫细胞募集到空域。嗜中性粒细胞跨上皮细胞迁移会释放毒性介质，如蛋白酶，ROS和NETs，它们在宿主防御中有重要作用，但会引起内皮和上皮损伤［10］。内皮损伤标志物主要为内皮素-1和VWF抗原［7］。PRRs一类包括细胞外环境中识别PAMPs和DAMPs且位于血浆和内体膜上的Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）和C型凝集素受体（C-type lectin receptors，CLRs）［15］。另一类包括识别细胞内环境中的DAMPs的RIG-Ⅰ样受体（RIG-Ⅰ-like receptor，RLRs），HIN200和NOD样受体（NOD-like receptors，NLRs），广泛存在于细胞质中［15］。对病原体识别有意义的一点是TLRs和NLRs均具有LRR域而不具有CARD解旋酶［14］。

2 ALI/ARDS中相关PRRs的结构和功能

2.1 跨膜PRRs据报道人类已经鉴定出10种功能性TLRs，负责感应细胞外、细胞内的内泌体和溶酶体中的入侵病原体，即在脊椎动物中高度保守的跨膜PRRs，包括定位于质膜的TLR2/1、TLR2/6、TLR4、TLR10以及定位于核内体的TLR3、TLR7、TLR8、TLR9［8，13］。具有不同N端糖基化程度的N末端富含亮氨酸的重复（leucine-rich repeat，LRR）结构域形成了负责病原体感应的特征性TLRs螺线管结构。单个跨膜结构域将LRR结构域连接到胞质Toll/IL-1受体（toll-like receptor/interleukin-1 receptor，TIR）C端尾端，该尾部募集TIR衔接子蛋白以启动下游信号转导［16］。

2.2 胞质PRRs NOD样受体（NOD-like receptors，NLRs）是可溶性胞质蛋白，由C端LRR结构域，中央核寡聚域（nuclear oligomerization domain，NOD）和可变N端效应域组成。通过其效应结构域进一步分为胱天蛋白酶募集结构域（caspase recruitment domain，CARD or NLRCs），热蛋白结构域（pyrin domain，PYD or NLRPs）或凋亡蛋白结构域的杆状抑制物（baculoinhibitor of apoptosis protein domain，NAIPs or NLRBs）［16］。与TLRs可以识别表面上的病原体相关分子模式（PAMPs）不同，NLRs在细胞内部被激活并形成炎症体的一部分，由具有不同NLRs（例如NLRP1b，NLRP3和NLRC4）的多蛋白复合物形成，这些炎症体还可以作为caspase-1激活平台来控制IL-1β和IL-18等白介素的成熟和分泌［17-18］。肺上皮细胞表达的NLRs包括NOD1和NOD2，其可以结合细菌肽聚糖，激活MAPK信号通路、NF-κB信号通路和自噬通路［16］。

RLRs是 胞 质PRRs，RLRs是DExD/H结 构 域RNA解旋酶家族的成员，可检测导致IFN（例如IFN-α和IFN-β）产生的RNA病毒，RLR家族包括RIG-Ⅰ，MDA5，LGP2受体［19-20］。RIG-Ⅰ和MDA5含有RNA解旋酶结构域和两个能触发下游信号通路的CARD样结构域，而LGP2缺乏CARD样结构域［19］。据研究LGP2可以调节RIG-Ⅰ和MDA5信号传导。在病毒感染期间，RIG-Ⅰ被dsRNA或5'-ppp RNA激活，而MDA5被dsRNA激活［20］。

3 PRRs在ALI/ARDS中的角色

3.1 TLRs在肺上皮细胞和经典免疫细胞之间，TLRs的表达和定位可能不同，研究发现在炎症条件下，TLR4重新定位于细胞膜，且对LPS敏感性增加，已被RSV感染的肺上皮细胞实验研究证实［14］。刺激TLR4可以触发两个下游信号传导途径的激活：依赖MyD88或依赖TRIF的途径。研究表明，通过TLR4-TRIF-TRAF6进行的先天性免疫信号传导是决定体内急性肺衰竭易感性的关键遗传途径［21］。一般情况下，PRRs活化炎症的主要方面是NF-κB依赖性基因转录，另一方面是IFN调节因子依赖性基因转录导致了IFN的产生以及随后IFN刺激基因的表达［14］。研究表明，LPS作为配体可以激活细胞膜上的TLR4，并启动下游炎症反应信号通路的表达，并最终通过上调炎症或坏死因子IL-1β、IL-6和TNF-α，产生炎症反应［22］。TLR信号通路中的TLR2在LPS诱导的ALI组织中显著过表达，实验发现甘草酸通过抑制TLR2可以减少LPS引起的ALI［23］。

3.2 NLRs NLRP3属于NOD样受体家族，是研究最多的NLRs，可以被PAMPs与DAMPs信号激活，形成多聚体蛋白复合物，称为NLRP3炎症体［15］。研究发现几种分子和细胞事件可以作为NLRP3炎症体激活的触发因素，包括K+外排、Ca2+信号传导、ROS、线粒体功能障碍和溶酶体破裂［24］。NLRP3炎症体作为一种细胞炎症反应途径，其高表达通常会触发慢性炎症反应过程并最终释放IL-1β和IL-18［22］。炎症体激活的标志是caspase-1介导的促炎细胞因子IL-1β和IL-18的分泌［25］。NLRP3的缺失可以防止高氧血症引起的ALI，因此，NLRP3炎症体可能是ALI药物治疗的有效靶点［26］。

3.3 RLRs RLRs家族受体RIG-Ⅰ和MDA5在病毒感染后，可以靶向病毒复制复合物（viral replication complexes，vRC），进而感知应激颗粒中的RNA病毒并形成抗病毒应激颗粒（antiviral stress Granules，avSG）［27］。MDA5或RIG-Ⅰ的激活会导致CARD与病毒信号（mitochondrial activator of virus signaling，MAVS）蛋白线粒体激活物的CARD相互作用，MAVS是RLRs的必需信号转导接头蛋白［28］。RIG-Ⅰ和MDA5通过共同的衔接子MAVS信号响应病毒感染而产生IFN，RLR级联分泌的IFN-β与IFN受体结合，以指导JAK-STAT信号传导和IFN刺激基因（interferon stimulated genes，ISG）ISGF3的依赖性表达，RLRs也导致IL-10家族细胞因子Ⅲ型干扰素（IFN-λ）的表达［29］。RLRs信号可与炎症体信号相互串扰，研究发现RNA病毒感染可通过MAVS诱导炎症体活化，MAVS与NLRP3相互作用并与线粒体相关膜（mitochondrial associated membrane，MAM）直接缔合，并促进NLRP3寡聚化，导致caspase-1激活并释放成熟的IL-1β驱动炎症反应［28］。

4 调控ALI/ARDS的作用机制

4.1 TLRs介导NF-κB信号通路有研究发现，禽流感病毒感染引起的ALI产生内源性氧化磷脂，可刺激TLR4，并发现缺乏TLR4的小鼠对禽流感致死率有耐药性，TLR4遗传失活可以显著减弱ALI，而TLR3、TLR9对肺病理没有影响，ALI的严重程度受造血细胞上TLR4表达的控制，并将TLR4鉴定为ALI的易感基因［13-21］。根据不同的适配器分子骨髓分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和TRIF的使用情况，TLR信号通路大致可分为两种不同的通路［13］。MyD88是TLR/IL-1受体（toll-like receptor/interleukin-1 receptor，TIR）通路的关键适配器，TIR能够促进ALI进展［30］。除TLR3外，所有TLR都共享MyD88依赖性途径来激活NF-κB。由TIRAP、MyD88、IRAK4、IRAK1和TRAF6组成的蛋白质复合物介导NF-κB刺激［14］。已被证实TLR4/TRAM/TRIF信号级联在流感病毒感染和酸性损伤模型可引起ALI/ARDS加重。TRIF信号通过IKK-ɛ和IRF3激活或通过TRAF6介导的NF-κB激活［21］。MyD88依赖TIR激活可引起下游分子核转录因子NF-κB激活，NF-κB激活导致编码炎症性细胞因子，急性期蛋白，免疫受体和趋化因子的基因表达增强，这些因子在募集嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞中扮演重要角色［30-31］。NF-κB激活后可进入细胞核，促进多种炎症因子的释放，如IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等［32］。MyD88基因敲除可抑制NF-κB激活，减少TNF-α和IL-1的表达和释放，可减缓ALI/ARDS［30］。

4.2 NLRP3炎症体及其信号通路NLRP3炎症体活化和IL-1β的后续成熟与ALI有关，导致炎症和纤维化。纤维增生在ARDS患者中较早出现，NLRP3炎症体的激活在ALI和肺纤维化中起重要作用，NLRP3炎症体的产物IL-1β是肺部急性炎症，是重塑和纤维化的关键介质，通过促进促纤维化介质的表达和成纤维细胞的活化，导致胶原沉积在肺内［33-34］。研究表明，NLRP3炎症体在各种感染性病因如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和病毒病原体如A型流感病毒引起的ALI中起关键作用［33，35］。细菌内毒素如LPS是可以激活TLR4受体，并通过NF-κB途径来上调NLRP3和pro-IL-1β、pro-IL-18的基因表达［15，18］，NLRP3炎症体活化可能与波形蛋白相关，其激活需要两个信号：第1个信号由微生物分子或内源性细胞因子介导，通过激活NF-κB信号通路上调NLRP3和pro-IL-1β的表达［33］。第2个信号由DAMPs介导，导致多蛋白复合物组装。激活后，caspase-1蛋白水解细胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18，导致IL-1β和IL-18的成熟和释放，IL-1β和IL-18分泌到肺环境中会导致ALI［35］。

4.3 MAPK信号通路在ALI/ARDS中的细胞因子如IL-1β、TNF-α等，主要是通过p38 MPAK信号通路，由几个的TLRs诱导的促炎症信号以及NOD1和NOD2涉及ERK、JNK和p38 MAPK激活［36］。MAPK信 号 组 分，包 括p38 MAPK、JNK、ERK［37］。p38 MAPK在多种环境和细胞压力或炎症细胞因子的作用下被强烈激活，其包括多个亚型［38］。目前大多数研究都集中在p38α上，p38γ和p38δ的作用有时被忽略［39］。研究表明，在作为炎症反应关键介质的巨噬细胞和树突状细胞中，p38γ和p38δ缺失均削弱了对TLR4和LPS的先天免疫应答。在来自p38γ/δ缺陷小鼠的LPS刺激的巨噬细胞中，TNF-α、IL-1β和IL-10的产生严重降低，而IL-12和IFN-β的产生增加［40］。阻断p38可下调内皮或上皮细胞的凋亡，对肺泡-毛细血管屏障通透性产生保护作用，阻断p38 MAPK信号通路可能通过抑制炎症性巨噬细胞凋亡引起的细胞死亡来抑制过度的肺部炎症［36］。

4.4 中性粒细胞胞外诱捕网NETs中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）存在于ARDS中，并与ARDS的严重程度和死亡率相关［41］。中性粒细胞通常与具有复杂血栓炎症活动的血小板相关，触发NETs形成，促使个体发生ARDS。有研究发现，血小板活化可诱导NETs形成，防止血小板活化或干扰NETs成分可保护肺部［2］。NETs是与中性粒细胞衍生的抗菌蛋白复合的丝状染色质纤维，是病原体封闭和清除的先天机制，但NETs过剩可导致炎症和损伤［10，42］。NETs结构由与组蛋白相关的DNA组成，也有粒状蛋白，如弹性蛋白酶和髓过氧化物酶，以及一些细胞质蛋白［43-44］。NETs可能导致肺泡-毛细血管受损，肺内皮受到炎症介质的攻击从其正常的抗血栓形成和抗炎表型转变为促血栓形成和促粘连［45-46］。研究发现，在流感病毒诱导小鼠中，嗜中性粒细胞过度募集、活化和毒性酶释放可加剧病毒感染对肺泡上皮的损害，导致血管渗漏，肺水肿和低氧血症，并最终发展为ARDS［45］。中性粒细胞浸润释放大量NETs，因其具有细胞毒性或充当内源DAMPs来促进先天免疫和系统性炎症。此外，NETs可能反过来将更多的炎症细胞吸引到受损部位，研究发现NETs在急性期通过促进巨噬细胞极化到M1表型而促进ARDS炎症［42］，并通过增加细胞因子产生来放大炎症，从而促进ALI/ARDS［44］。

4.5 Nrf2信号通路和自噬在ALI/ARDS中，急性炎症发生时，肺中多种细胞包括内皮细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞，可能产生活性氧（ROS），也可能是高氧血症导致的线粒体或酶系统功能异常而产生ROS［47-48］。近年来，包括氧化磷脂（oxidized phospholipids，OxPLs）在内的氧化基团被认为是PAMPs，被一些保守的PRRs检测到，并发现酸的吸入可触发肺氧化应激机制和OxPLs的产生，触发巨噬细胞产生细胞因子，并通过TLR4激活Nrf2通路并诱导自噬，引起ALI［21，49］。研究表明，Nrf2可能是人类ARDS易感性的候选基因［50］。Nrf2作为基本亮氨酸拉链保护转录因子，在调节氧化应激反应和抗氧化基因方面起着关键作用［51］。氧化应激是由于抗氧化系统失调而导致细胞抗氧化能力和ROS形成失衡的状态［51］。众所周知，氧化应激介导的Nrf2磷酸化、Keap1的氧化修饰和共价修饰以及蛋白酶体抑制与Nrf2的大量激活有关［52］。在ALI/ARDS中，ROS修饰Keap1，使Nrf2无法泛素化，并进入细胞核，与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）结合，并参与ARE相关基因表达及转录［47，51］。Nrf2也可以在ALI/ARDS期间通过自噬来调节。衔接子p62是一种自体吞噬接头蛋白，p62与Keap1结合，将其隔离到自噬体中并允许Nrf2积累，达到Nrf2通过调节自噬来保护肺损伤的作用［47，49，53］。

4.6 RAGE信号通路晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是一种促炎症模式识别受体PRRs，RAGE在肺远端与肺泡上皮共定位，其具有放大细胞炎症反应的功能［54-55］。RAGE是免疫球蛋白超家族的跨膜受体，主要位于Ⅰ型细胞基底表面并被认为是Ⅰ型肺泡细胞损伤的新标志物，RAGE与ARDS严重程度及预后相关［56-57］。ARDS期间RAGE表达上调显著，减少RAGE活化可能是肺损伤的治疗靶标［58］。激活的RAGE通过保持稳定的新合成NF-κBp65信使RNA和蛋白质导致核转录因子NF-κB持续响应。RAGE信号的主要副产物是形成ROS，其不同配体又可同时激活NF-κB和其他促进炎症机制，如增加VCAM-1的表达或细胞凋亡，引起持续炎症反应可导致

ALI［55-56，59］。

5 总结与展望

目前，SARS-CoV-2病毒正处于全球大流行，其严重感染者也可并发ARDS、败血症和脓毒症休克以及多器官衰竭。高致病性CoVs、甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）和埃博拉病毒会引起细胞因子/趋化因子过度和长时间的反应，即细胞因子风暴，ALI是肺泡环境和体循环中细胞因子风暴的常见后果，大多数死于这些病毒的患者都会出现ARDS［3-4］。ARDS是ICU中多因素病因学综合征，其病理生理学包括细胞凋亡过程，以及中性粒细胞通过IL触发炎症过程，导致间质水肿，在某些情况下还包括纤维化再生过程［7］。PRRs作为人体免疫的第一道防线，单个PRRs诱导多效性结果的细胞机制是复杂的，是各种PRRs之间相互作用介导的，目前我们还远远不能预测整个免疫反应［13］。降低特定PRRs的活性，但仍允许其他PRRs对感染作出反应，可采取针对特定领域PRRs结构以及针对激酶活性或信号传导中涉及的一些调节蛋白的策略［60］。由于巨噬细胞可以利用依赖TRIF和MyD88的两种途径来诱导细胞因子，可通过TRIF抑制来最小化ALI，同时又不影响依赖MyD88的先天免疫功能［21］。TLR4信号涉及多种炎症过程，抑制TLR4受体并调节其信号通路可能成为ALI的有效治疗策略［61］。

研究显示OxPLs可通过TLR4-TRIF信号增加A型流感病毒感染小鼠肺巨噬细胞因子/趋化因子的产生来促进ALI，因此，抑制OxPLs的策略可能对抑制hCoVs诱导的炎症有价值［4］。血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）通过抑制LPS-TLR4途径对LPS诱导小鼠ALI具有保护作用，且ACE2是病毒的进入受体，采取ACE2相关疫苗、抑制物等可能成为有效措施［5，62］。TLR激活物和拮抗物在抗病毒药物和疫苗佐剂的应用中可能是一种具有治疗多种呼吸道感染广谱潜力的化合物，TLR3和TLR4激活物对SARS CoV感染有保护作用［63］。

本文从PRRs所包括的跨膜受体、胞质受体以及炎症通路，阐述PRRs在ALI/ARDS发病机制中的作用，未来进展将取决于开发新的可以促进和加强肺修复的疗法，以期为重大疾病中发生的ALI/ARDS提供新的治疗思路。