古方三白汤不同溶剂提取物美白作用比较研究

贾俊芳，孟德新，李淑霞，戴晓侠

（1.山东药品食品职业学院，山东威海 264210；2.济南市章丘区中医医院，山东济南 250200）

古语云“一白遮百丑”，白皙的皮肤一直是爱美人士的追求，在护肤品中，美白祛斑类产品一直广受关注。但是近年来由于美白化妆品的需求巨大，使得一些不法商人利用大家的爱美之心，牟取暴利。根据国家食品药品监督管理网站通报，可以看出美白祛斑类化妆品成为化妆品违法的重灾区，由于不合格产品导致的皮肤损伤以及身体损伤也常见报道。中药因其主要来源于植物，温和安全，近年来成为美容护肤研究的热门原料。目前对于中药美白作用的研究越来越多，越来越深入，有文献报道具有酪氨酸酶抑制活性的中药有人参、甘草、红景天、黄芩、当归、川芎等，其中甘草、人参抑制活性最为明显[4-14]。三白汤来源于明代的《医学入门》，由白芍、白术、白茯苓、甘草组成，水煎，温服。此方配伍简洁精当，适于气血虚寒导致的皮肤粗糙、萎黄、黄褐斑、色素沉着等[15]。但是三白汤作为具有美容作用的传统方剂，目前有研究证实白芍多糖、茯苓三萜、甘草苷、甘草酸等均具有酪氨酸酶抑制活性，白术具有较好的抗氧化活性[16-21]。但关于方剂三白汤的美白活性研究和现代应用均较少，本文将对不同溶剂的三白汤提取物的体外酪氨酸酶抑制活性进行对比，考察其美白效果，同时筛选最佳提取工艺，为制备安全、高效的天然美白产品提供理论依据。皮肤的颜色取决于皮肤中黑色素的数量，黑色素由人体表皮基底层的黑色素细胞产生。黑色素细胞中的酪氨酸在酪氨酸酸酶的催化下羟化为3,4-二羟基苯丙氨酸，即多巴，进一步氧化作用下形成多巴醌。从多巴醌可通过两条不同的途径生成真黑素与褐黑素。由此可以看出，酪氨酸氧化是黑色素合成的起始步骤，酪氨酸酶是黑色素合成中的关键限速酶。黑色素的生成和转运是一个复杂过程，除酪氨酸酶外，还有多巴色素互变酶、过氧化物酶、DHICA氧化酶等，同时黑色素细胞的数量、活性也对黑色素数量有影响[1-2]。根据黑色素生产原理可以发现，皮肤美白的主要方法为减少黑色素沉积，目前主要的方法有：抑制黑色素形成；还原黑色素，防止光氧化；促进黑色素代谢；防止紫外线进入等。根据文献分析，显示研究得最多的是抑制黑色素的生成。美白作用主要的评价方法为生物化学法，在体外考察美白成分对酪氨酸酶活性影响；细胞生物学法，以人黑素细胞、鼠黑素瘤细胞等为模型，考察美容成分对细胞黑色素数量的影响；动物实验，以豚鼠、小鼠等为模型，应用成分后考察其皮肤黑色素数量变化；人体实验，应用于皮肤，通过肤色变化考察美白成分作用效果[3]。因此酪氨酸酶抑制实验可以对活性成分进行初步的祛斑美白功效评价[4]。

1 材料与仪器

药材：白芍（1907180143，产地补充）、白术（1904150032，产地四川），白茯苓（1906200522，产地辽宁），甘草（1902210312，产地江苏），均购自安徽亳州药材市场，经鉴定为真品。

试剂：L-多巴（BR，西安润泽生物技术有限公司），蘑菇酪氨酸酶（25KU，BR，阿拉丁试剂有限公司），曲酸（BR，山东优索化工科技有限公司），熊果苷（BR，山东优索化工科技有限公司），磷酸盐混合物（pH=6.8，AR，天津市大茂化学试剂厂），无水乙醇（AR，国药集团化学试剂有限公司），纯净水（AR，自制）。

超声微波清洗器（KQ3200DE，昆山禾创超声仪器有限公司），紫外可见光分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限公司），恒温水浴锅（HH-4，巩义市予华仪器有限责任公司），pH计（PHSJ-4A，上海仪电科学仪器股份有限公司），电子天平（LE204E，奥豪斯），手动单道可调式移液器（100μL、200μL、1000μL，大龙兴创实验仪器），小型多功能粉碎机（500g，广州是渲龙厨具有限公司），金属筛（40目，广州是渲龙厨具有限公司）。

2 方法与结果

2.1 试剂配制

磷酸盐缓冲液（PBS，pH=6.8）：将适量磷酸缓冲盐用纯净水溶解，在250mL容量瓶中按照要求稀释至刻度，摇匀。

酪氨酸酶溶液配制：将酪氨酸酶用上述配制的磷酸缓冲盐溶解，配制成浓度为250U/mL的溶液。

L-多巴溶液配制：精密秤定L-多巴适量，加入上述配制好的磷酸缓冲盐溶液，配制成浓度为5mg/mL的溶液。

2.2 不同溶剂三白汤提取物的制备

精密称取白芍、白术、白茯苓、甘草各300g，将各药材采用粉碎机粉碎，过40目筛，白芍、白术、白茯苓、甘草按照2∶2∶2∶1的比例混合均匀。称取5g混合药材粉末三份，分别加入50mL纯净水、50mL 50%乙醇、50mL乙醇，40℃超声提取30min，过滤，将滤液蒸干，加入5mL配制好PBS溶解，备用。将溶解的提取物用磷酸缓冲盐溶液稀释成100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL，10mg/mL、5mg/mL、1mg/mL 6个浓度。

2.3 酪氨酸酶抑制活性测定

采用酪氨酸酶多巴速率氧化法检测，在对照组加入1.8mL配制好磷酸盐缓冲液（pH=6.8）和0.2mL酪氨酸酶溶液；空白组加入2mL磷酸盐缓冲液，三白实验组加入磷酸盐缓冲液0.8mL，酪氨酸酶溶液0.2mL和三白提取物溶液1.0mL；三白对照组加入磷酸盐缓冲液1.0mL和三白提取物溶液1.0mL。以上溶液按要求移至试管，摇匀，置37℃水浴中温育10min。取出后每个试管中加入L-多巴溶液1.0mL，反应 2min 后于紫外分光光度计（475nm）测定其吸光度（A）值。

按下列公式计算酪氨酸酶的抑制率：

Aa=对照组样品吸光度；Ab为空白组样品吸光度，Ac为三白反应组吸光度；Ad为三白对照组吸光度

实验结果见图1。

图1 三白汤不同提取物酪氨酸酶抑制率

从图1看出，不同溶剂三白汤提取物对酪氨酸酶活性均有不同程度的抑制作用，抑制活性均随浓度的升高而增强，说明三白提取物对酪氨酸酶的抑制活性呈现浓度依赖性。在同等浓度下，50%乙醇提取物的抑制作用最强，抑制率高达86.19%，抑制活性非常明显。

3 三白提取物最佳提取工艺考察

3.1 提取方式的考察

精确称量三白汤粉末5g，加入10倍量的50%乙醇作为提取溶剂，其中一份药材40℃超声提取30min，一份药材加热回流1h，过滤，将滤液蒸干加配制好的磷酸缓冲盐溶液溶解后，稀释成浓度为50mg/mL溶液，按上述酪氨酸酶抑制实验方法，对比考察不同提取方式提取的三白提取物的酪氨酸酶抑制活性。

实验表明，提取方式加热回流法制备的三白汤提取物与超声法提取的三白提取物对酪氨酸酶抑制活性分别为83.33%和83.13%，二者区别不大，但超声提取法操作更方便，同时时间更短，温度也较低，减少活性成分分解，因此为了保护有效成分，提高提取效率，选择超声法作为三白提取物的提取方法。

3.2 提取温度的考察

精确称量三份三白汤粉末，加入10倍量的50%乙醇作为提取溶剂，分别在常温（20～30℃）、40℃、50℃下超声提取30min，过滤，将提取液蒸干加入配制好的磷酸缓冲盐溶液溶解后，制备成浓度为50mg/mL溶液，按上述酪氨酸酶抑制实验方法考察不同提取温度提取的三白提取物的酪氨酸酶抑制活性变化。

常温下超声提取，三白提取物酪氨酸酶抑制率为82.13%，40℃下提取抑制率为83.49%，50℃下提取抑制率为79.57%。实验结果表明，在低于40℃时，随着提取温度的增加，三白提取物对酪氨酸酶的抑制活性逐渐增加，但50℃提取时三白提取物对酪氨酸酶抑制活性降低，因此选择40℃超声提取作为三白提取物的提取温度。

3.3 提取溶剂体积的考察

精确称量三白汤粉末三份，加入8倍量、10倍量、12倍量的50%乙醇作为提取溶剂，40℃超声提取30min，过滤，将提取液蒸干加配制好对磷酸缓冲盐溶液溶解后，制备成浓度为50mg/mL溶液，按上述酪氨酸酶抑制实验方法，对比考察提取溶剂体积对三白提取物的酪氨酸酶抑制活性的影响。

8倍量体积比提取的三白提取物酪氨酸酶抑制率为80.24%，10倍量提取的抑制率为83.15%，12倍量提取物的抑制率为83.01%。实验表明，8倍量溶剂提取的提取物酪氨酸酶抑制活性较低，溶剂体积10倍和12倍对提取物酪氨酸酶活性影响不大，为了节约溶剂，因此选择10倍量作为三白提取工艺的溶剂体积。

通过上述实验，以酪氨酸酶活性抑制率为指标，最终确定三白提取物的最佳提取工艺为：精密称取白芍、白术、白茯苓、甘草适量，将各药材采用粉碎机粉碎，过40目筛，白芍、白术、白茯苓、甘草按照2∶2∶2∶1的比例混合均匀。药材按照精确称定药材粉末适量，加入10倍量的50%乙醇，40℃超声法提取30min，制得三白提取物原液。

4 结束语

随着国家对中医药发展的整体推动及人们对中医药文化的了解深入，近年来对于中药美白的研究越来越多，也越来越深入。三白汤作为传统古方，长期临床应用证明其具有较好的美白祛斑的功效，同时，三白汤四味药物均被收录于《已使用化妆品原料名称目录》，安全性得到保障，可以直接作为化妆品原料制备化妆品。虽然现在对于中药美白作用的研究较多，但对于传统方剂的美白作用研究较少。因为中药成分的复杂性和质量的不稳定性，使其在现代护肤产品开发应用时存在很大困难。本文通过体外酪氨酸酶实验对三白汤提取物的美白活性进行了初步研究，结果表明三白汤50%乙醇提取物、乙醇提取物均有较好的酪氨酸酶抑制活性，同时以酪氨酸酶活性为评价指标，对三白汤提取物的制备条件进行了考察，为三白汤系列美白产品的开发提供了理论基础。但是酪氨酸酶抑制实验只能检测对酪氨酸酶有较好作用的美白添加剂，而不能反映美白添加剂是否能透皮被吸收，也不能反映与黑色素合成有关的其他机制，因此，还需进一步采用细胞实验、动物实验、人体皮肤实验等进行验证。同时，三白系列化妆品的开发还需对三白提取物质量标准进行研究，以保证稳定的三白提取物含量的稳定性。三白汤作为纯天然植物成分，美白效果较好，提取方法简单易行，三白汤在美白祛斑化妆品应用领域具有广阔应用前景。