使用无水乙醇为浸提介质进行血液灌流器的遗传毒性试验研究

陆金健 王嘉铭 南方 杨文润 广东省医疗器械质量监督检验所 （广东 广州 510080）

内容提要： 目的：通过试验探索无水乙醇作为血液灌流器遗传毒性试验浸提介质的可行性。方法：将无水乙醇作为浸提介质使用灌注的方式充满灌流器，使用浸提液分别进行细菌回复突变试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验和体外哺乳动物细胞染色体畸变试验。结果：细菌回复突变试验中与阴性对照组相比5种菌株自发回复突变菌落数均无显著性差异；体外哺乳动物细胞基因突变试验中所有组的总突变频率与阴性对照组相比在统计学上无显著性差异；体外哺乳动物细胞染色体畸变试验中染色体畸变率与阴性对照组相比无显著性增加。结论：无水乙醇作为浸提介质时对试验体系中的细菌、细胞生长无影响，且在本试验条件下无致突变性，选择无水乙醇作为浸提介质进行试验是可行的。

血液灌流是通过血液灌流器吸附作用来清除血液中的内源性或外源性毒素，并将净化了的血液回输到体内的一种血液净化的方法，可有效清除血液中的中大分子物质，代谢废物以及毒素[1]。血液灌流器在医疗领域主要应用于急性药物和毒物中毒、尿毒症毒素的清除、降脂的新疗法、提高移植肾的存活率及治疗皮肤病等。属于血液循环短期接触的外部接入医疗器械，根据GB/T 16886.1-2022《医疗器械生物学评价 第1部分：风险管理过程中的评价与试验》[2]的要求需进行遗传毒性试验。遗传毒性试验可用于评价器械及其浸提液引起的基因突变、染色体结构和数量的改变以及其他DNA或基因毒性。本试验采用GB/T 16886.3-2019《医疗器械生物学评价 第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验》[3]中推荐的细菌回复突变试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验和体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的组合。

由于血液灌流器主要是通过其吸附性对血液进行净化，当使用含血清培养基作为浸提介质进行遗传毒性试验时，会吸附血清蛋白等其他一些未知的营养成分，导致含血清培养基中细胞生长的一些营养物质不足，影响细胞的生长，使得试验无法正常进行[4]。本试验采用无水乙醇做为浸提介质，采用灌注的方式进行浸提，探究无水乙醇做为血液灌流器浸提介质进行遗传毒性实验的可行性。

1.材料与方法

1.1 一般材料

本试验起止时间：2022年7月18日～2022年8月25日。

菌株：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷性菌株TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535（MOLTOX公司），购自上海宝录生物科技有限公司。使用前经组氨酸缺陷型、脂多糖缺陷、R因子、四环素、uvrB修复缺陷性和自发回复突变鉴定合格，且传代次数均在5代以内[5]。

细胞株：小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y TK+/－3.7.2C）、中国仓鼠肺细胞（CHL），均购自中国科学院细胞库提供，小鼠淋巴瘤细胞经过THMG进行自发突变清除，自发突变频率在50×10-6～170×10-6之间[6,7]。

主要试剂：胎牛血清、热灭活牛血清、RPMI1640培养基、双抗购自GIBCO公司，无水乙醇、组氨酸、生物素、氯化钠、三氟胸苷购自、甲磺酸甲酯、丝裂霉素C、秋水仙素均购自Sigma公司，葡萄糖-6-磷酸、辅酶Ⅱ、环磷酰胺购自阿拉丁试剂有限公司，技术琼脂粉购自广东环凯微生物科技有限公司，PBS、底层培养基购自索莱宝生物科技有限公司，甲醇、冰醋酸购自广州化学试剂厂。0.9%氯化钠注射液购自广东科伦药业有限公司，S9（MOLTOX公司）现配现用。

主要仪器：生物安全柜（新华医疗）、二氧化碳培养箱（Thermo）、空气浴培养摇床（德国IKA）、恒温水浴锅（德国JULABO）、涡旋仪（汗诺仪器）、细胞计数仪（Life Technologies）、倒置显微镜（olympus）、显微数码成像系统（徕卡）、台式离心机（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 细菌回复突变试验

1.2.1.1 试验液制备

试验组：无菌操作，取样品整体加入无水乙醇灌满，在37˚C下浸提72h。阴性对照组：无菌操作，取样品整体加入0.9%氯化钠注射液灌满，在37˚C下浸提72h。阳性对照：加S9：TA97、TA98、TA100、TA1535 0.1mg/mL 2-氨基芴，TA102 0.5mg/mL 1，8-二羟基蒽醌；不加S9：TA97、TA98、TA102 1.0mg/mL敌克松，TA100、TA1535 1.0mg/mL叠氮化钠。

1.2.1.2 试验方法

取营养肉汤培养基5mL，加入无菌小三角瓶或无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，在37˚C、120r/min振荡培养12h至对数生长期，活菌数不少于1×109CFU/mL。融化顶层培养基分装于无菌小试管，每管2mL，在45˚C水浴中保温。

在保温的顶层培养基中依次加入样品液0.1mL、新鲜细菌培养物0.1mL和10%S9混合液0.5mL。无活化组加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液0.5mL。试管内容物混合后铺至最低琼脂营养平板的表面。在培养前待顶层琼脂固化。样品组分别设三个平行皿。

阴性对照组分别加入0.1mL同批浸提介质和新鲜细菌培养物0.1mL，活化组再加10% S9混合液0.5mL，无活化组加0.2 mol/L磷酸盐缓冲液0.5mL；阳性对照组分别加入诱变剂0.1mL和新鲜细菌培养物0.1mL，活化组再加10% S9混合液0.5mL，无活化组加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液0.5mL。阴性及阳性对照组分别设3个平行皿。全部平皿置37˚C倒置培养72h观察各个皿内细菌的生长状况并对各个皿的菌落数进行统计。

1.2.2 体外哺乳动物细胞基因突变试验

1.2.2.1 试验液制备

试验组：无菌操作，取样品整体加入无水乙醇灌满，在37˚C下浸提72h。阴性对照：无菌操作，取样品整体加入不含血清的RPMI1640培养基灌满，在37˚C下浸提72h，试验前加入终浓度为10%的胎牛血清。阳性对照：无活化组为甲磺酸甲酯，活化组为环磷酰胺。

1.2.2.2 试验方法

取生长良好的细胞，调整密度为1×106/mL。无活化系统组取10mL细胞悬液与0.2mL试验液或对照品以及PBS 1mL混合，加入含血清培养基至终体积为20mL；有活化系统组取10mL细胞悬液，加入0.2mL试验或对照样品以及S9混合液1mL，加入含血清培养基至终体积为20mL。

将上述混合液置于37˚C，5% CO2，饱和湿度条件下处理4h（有和无活化系统）和24h（无活化系统）。处理结束后离心，弃上清液，用磷酸缓冲盐溶液或不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10%血清的RPMI 1640培养液中，并调整细胞密度为2×105/mL。

PE0平板：PE0（0天的平板接种效率）测定：取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6个细胞/孔），每个剂量作2块板，37˚C，5% CO2，饱和湿度条件下培养12d，计数每块平板有集落生长的孔数。

PE2平板：第2天表达培养结束后，按PE0接种。每天计数细胞密度并保持密度在106/mL以下。

TEF拮抗平板：第2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×104/mL，加入TFT（三氟胸苷，终浓度为3µg/mL），混匀，接种96孔板（每孔加0.2mL，即平均2000个细胞/孔），每个剂量作2块板，37˚C，5% CO2，饱和湿度条件下培养12d。

对PE0，PE2平板计算无集落生长的孔数，对TFT抗性拮抗平板应计算无小集落孔数、无集落孔数。每个剂量组数据求平均数，计算平板效率PE=-ln（EW/TW）/1.6、相对存活率RS=PE0(样品组)/PE0(对照组)×100%、TFT抗性突变频率T-MF=[-ln(EW/TW)/n]/PE2和小集落突变百分率SCM(%)=(S-MF)/(T-MF)，同时对每组平板突变频率进行统计学分析。

1.2.3 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

1.2.3.1 试验液制备

试验组：无菌操作，取样品整体加入无水乙醇灌满，在37˚C下浸提72h。阴性对照：无菌操作，取样品整体加入不含血清的RPMI1640培养基灌满，在37˚C下浸提72h，试验前加入终浓度为10%的胎牛血清。阳性对照：无活化组为丝裂霉素C，活化组为环磷酰胺。

1.2.3.2 试验方法

接种一定数量细胞，置于CO2培养箱培养。在细胞长满培养瓶50%左右时吸出培养液，加入对照品或供试品、S9混合液（不加S9混合液时，需用PBS补足）、以及新鲜培养液，无水乙醇浸提液的终浓度为1%（V/V）。全部置于培养箱中。短期接触组接触结束后吸去培养皿中的液体，用PBS清洗细胞3次，加入含血清培养基继续培养。阴性对照组和阳性对照组同法制备。所有试验组于24h内收获细胞，收获前4h加入终浓度为1µg/mL秋水仙素。接触处理结束后，加入适量胰酶将细胞消化收集取出，用5mL 0.075mol/L氯化钾溶液低渗一次，固定液固定两次后制片。封片晾干后在光学显微镜下每一试验组选择200个分散良好的中期分裂相进行染色体畸变分析，记录畸变细胞数目，计算相对细胞增长数。

2.结果分析

2.1 细菌回复突变试验

细菌回复突变试验结果见表1。72h培养结束后，试验组的五种菌株均可正常生长，且在加与不加S9条件下，自发回复突变数均小于阴性对照组的2倍；阳性对照组自发回复突变数均大于阴性对照组的3倍。

表1.细菌回复突变试验菌落数

2.2 体外哺乳动物细胞基因突变试验

体外哺乳动物细胞基因突变试验结果见表2。与阴性对照组相比较试验组短期接触组、活化组和长期接触组的相对存活率分别为96.36%、109.20%和113.73%，未出现明显细胞毒性。突变频率分别为69.53×10-6、66.66×10-6和53.59×10-6，无显著性差异。

表2.体外哺乳动物细胞基因突变试验结果统计

2.3 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验结果见表3。试验组各个组的相对细胞增长数均不低于80%。每组观察200个分散良好的中期分裂相，活化组阴性对照畸变率为0.5，非活化长期接触组畸变率为0.5，除阳性对照外其余试验组均未发现畸变细胞。

表3.体外哺乳动物细胞染色体畸变试验结果

3.讨论

血液灌流器属于血液循环短期接触的外部介入医疗器械，是三类医疗器械，考虑到其可沥滤物可能进入血液并在其移除后还会存在，因此需进行遗传毒性试验。导致医疗器械产生遗传毒性的原因多种多样，单一试验无法检测出所有遗传毒性物质，需根据实际情况选择试验组合[8,9]。遗传毒性主要表现为基因突变和染色体损伤，细菌回复突变试验可检测出绝大部分的DNA损伤遗传毒性物质，但某些特定的例如卤烃类物质却无法检出，且细菌为原核生物，采用细菌进行试验不具有代表性，需增加哺乳动物细胞进行补充试验。体外哺乳动物细胞基因突变试验和体外哺乳动物细胞染色体畸变试验可检测出造成DNA损伤和染色体畸变的遗传毒性物质，本试验选择体外哺乳动物细胞基因突变试验、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验与细菌回复突变试验进行组合[10]。遗传毒性试验常用的浸提介质有含血清培养基、无血清培养基，0.9%氯化钠注射液和二甲基亚砜，因不同类型浸提介质可浸提出的物质不同，采用单一浸提介质进行试验存在潜在风险，所以选择两种不同的浸提介质进行试验[11]。因血液灌流器主要是利用了内部填充物的吸附作用达到治疗效果，在使用含血清培养基作为浸提介质进行试验时，往往会出现细胞无法正常生长导致试验无法进行的现象。二甲基亚砜作为一种优质的有机溶剂，可溶解绝大部分有机物，采用灌注的方式对血液灌流器进行浸提可能会导致某些材料发生溶解，破坏了器械的完整性。在GB/T 16886.3-2019标准中这是不被允许的。所以含血清培养基和二甲基亚砜不适用于血液灌流器的浸提。而乙醇作为一种有机溶剂，可与试验体系混溶，且树脂，活性炭均不溶于乙醇，且由试验结果可以看出，用无水乙醇作为浸提介质时在细菌回复突变试验中，5种细菌均可正常生长回复突变数无明显变化。在体外哺乳动物细胞基因突变试验中各试验组的相对存活率均在90%以上，未表现出明显的细胞毒性。在体外哺乳动物细胞染色体畸变试验中各试验组的相对细胞增长数均不低于80%，说明在本试验条件下，乙醇对CHL细胞为表现出细胞毒性。在遗传毒性方面三个试验均未表现出阳性结果，由此可见在本试验条件下无水乙醇作为浸提介质本身并不具备遗传毒性[12]。固选择无水乙醇作为浸提介质进行试验是可行的。但考虑到细胞毒性的影响，且细胞生长需要较丰富的营养物质，浸提后的0.9%氯化钠注射液和无水乙醇无法作为试验液直接进行试验，在GB/T 16886.3-2019中的附录A中提到采用0.9%氯化钠注射液作为浸提介质时需用含血清培养基稀释至10%再进行试验，采用无水乙醇作为浸提介质时需用含血清培养基稀释至1%再进行试验。由于0.9%氯化钠注射液和无水乙醇均采用稀释液进行试验，考虑到稀释后可能导致毒性无法检出，固采用无血清培养基浸提后补充10%血清作为浸提介质与无水乙醇进行组合，对血液灌流器进行遗传毒性检测。