人骨肉瘤裸鼠胫骨原位移植动物模型

吴文涛，田振，陈锦鸿，娄朝晖

(郑州大学第一附属医院 骨五科，河南 郑州 450000)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一种起源于间充质的恶性肿瘤，起源于成骨细胞系，其特征是产生类骨样基质[1-2]。OS主要发生在承重骨的干骺端区域，最常见的是股骨远端、胫骨近端和肱骨近端[3]。在青少年中，OS发展的高峰期在10～20岁，与骨骼生长加速相关的快速骨转换相关[4]。在生物学上，OS表现为高级别肉瘤，具有侵袭性的溶骨特性和强烈的远处转移倾向。能够扰乱局部骨骼微环境，通过血液途径传播到远处的内脏器官，最常见的是肺实质[5-6]。少数情况下，OS可能会通过淋巴引流转移到区域淋巴结[7]。靶向、免疫治疗作为肿瘤治疗的新方法，近年来得到了很大的发展，但骨肉瘤患者的总体预后依然没有明显改善，晚期患者的5 a生存率仍然处于较低水平。

目前，原发肿瘤和肺转移的骨肉瘤动物模型仍不能全面准确地概括人类的自然疾病过程。但有助于增进我们对骨肉瘤生物学的理解，并将有助于发现疾病的发病机制和确定新的治疗策略。将小鼠(同种移植)或人(异种移植)癌细胞悬浮液注射到原位是诱发小鼠骨肉瘤最常用的方法[8-9]。大多数人骨肉瘤细胞系不会致瘤，在裸鼠体内也没有转移能力[10]。最近，有研究将患者活检获得的肿瘤材料植入免疫缺陷动物[11-12]，以此来模仿人类骨肉瘤成瘤及转移过程，并成功获得了骨肉瘤动物模型。这种患者来源的异种移植物形成的小鼠模型，优点是有可能通过保留原始的肿瘤来扩大肿瘤组织，保持与原肿瘤细胞的相似性。但这种方式获得的骨肉瘤动物模型的可靠性和可重复性有待进一步验证，为此本研究开展了下面的实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物24只，雌性，nu/nu BALB/cA Bom，4～6周龄裸鼠，购自河南省实验动物中心，动物级别为SPF级实验动物，裸鼠在恒温[(25±0.5)℃]、恒湿(50%)的无特定病原体条件下保存。在实验过程中，统一饲养所有实验动物，提供相同且标准化的饮用水和动物饲料，并且根据医学伦理标准，处理实验过程中的所有动物。

1.2 人骨肉瘤原发肿瘤从手术中获得了1名12岁骨肉瘤女性患者的原发肿瘤，原发肿瘤位于胫骨近端，大小约4.0 cm×3.5 cm×3.0 cm。术前已经进行了穿刺活检，病理学上已经诊断为高级别骨肉瘤，以确保获得的肿瘤组织是骨肉瘤组织。原发肿瘤是成软骨细胞型的骨肉瘤，间质细胞形态多样，染色质密度不同。原发肿瘤侵及骨骼，穿透皮质，周围骨骼肌、脂肪和结缔组织也可见肿瘤浸润。

1.3 异种皮下种植将人骨肉瘤组织切碎，并选择肿瘤中有活力的部分。在局部麻醉下，常规皮肤消毒，分别在2只裸鼠双侧前腿根部前上方的背部用眼科剪剪开皮肤，约0.5 cm大小，镊子扩开皮下通道约2 mm，将肿瘤组织块置于皮下，手术缝合。术后立即送至风净化笼具饲养，每周观察接种的小鼠的一般外观，并使用滑动卡尺测量肿瘤的三维大小。当肿瘤直径达到大约15 mm时，处死携带肿瘤的裸鼠。在无菌条件下，留取裸鼠皮下移植肿瘤物按同样方法进行连续传代3次[13-14]，各代肿瘤体内增殖稳定，致瘤率均为100%，无远处转移，其显微结构形态符合人骨肉瘤的特征。

1.4 成瘤组织块移植采用第3代异种皮下移植物进行原位移植。在无菌条件下，将可存活的肿瘤组织在磷酸盐缓冲盐水中剪切成直径约0.5 mm的碎片备用。麻醉裸鼠，用体积分数为70%的乙醇清洗裸鼠左腿，然后在靠近裸鼠膝关节前下方处切开左小腿，暴露胫骨前结节内侧近端皮质，用1 mL一次性无菌注射器针头倾斜45°沿胫骨远端方向插入钻孔，当出现落空感时即可，在局部造成直径约2.0 mm的骨缺损，抽出少量的骨髓液减小髓腔压力，将制备好的碎块置入胫骨髓腔内，骨蜡封闭钻孔后逐层缝合，切口用红霉素眼膏涂抹。手术后在恒温[(26～27)℃]、恒湿(45%～50%)半屏障系统环境中饲养，每日观察手术切口变化，直至完全愈合。

1.5 记录裸鼠的一般情况造模后，每天喂食前观察它们的行为特征等基本情况，每隔3 d记录1次。每周末对所有动物称重1次，并进行观察和记录，每次均在喂食前进行称量。在进行裸鼠原位移植后每隔1周测量肿瘤相互垂直的两直径D1和D2，按以下公式计算体积(V)：

V=(4/3)π[1/4(D1+D2)]3。

1.6 评价骨内肿瘤生长和转移的形成每天检查裸鼠的一般外观和局部胫骨肿瘤的生长情况。于移植后4周麻醉后颈椎脱位处死。尸检时切除左侧胫骨和股骨远端，将后肢小腿进行正、侧位X射线检查。

1.7 肿瘤的病理学检测将组织固定在体积分数为4%的甲醛水溶液中，胫骨和股骨脱钙，所有组织常规石蜡包埋。组织学检查：切片4～6 mm，苏木精-伊红(HE)染色。

1.8 免疫组化检查查阅初始人骨肉瘤手术标本病理报告并选择报告中的免疫组织化学指标(p53、Ki67、CD117、Bcl-2、Bcl-4)，测定裸鼠胫骨移植瘤免疫组织化学指标的表达情况，以确定移植瘤是否保留了原始肿瘤的生物学特性。

2 结果

2.1 实验动物观察分析实验操作过程中裸鼠未发生胫骨骨折，2只裸鼠术后5 d内死亡，考虑感染，总体而言，随着裸鼠造模手术切口愈合后，活动量逐渐下降，精神状态慢慢恶化，觅食习惯逐步改变，裸鼠质量随着天数的增加逐渐增加(P<0.05)。移植后1周的裸鼠均未出现肉眼可见的胫骨肿瘤，2周后肿瘤体积开始随着天数的增加而逐渐增加(P<0.05)。移植4周后存活的裸鼠尸检发现了肉眼可见的胫骨肿瘤。见表1。

表1 移植后肿瘤生长及成瘤情况

2.2 影像学表现X线显示，胫骨肿瘤具有人类原发骨肉瘤的特征，包括中央性骨溶解、毛刺状新骨形成和向周围软组织延伸。见图1。

图1 移植后3周X线片可见干骺端骨质破坏

2.3 病理学表现裸鼠肿瘤具有明显的包膜，质地比较坚硬，表面存在结节，血管分布广泛。显微镜检查显示肿瘤在髓内生长至胫骨干骺端。2只裸鼠移植肿瘤穿透皮质并渗入周围的软组织，但骨骺线始终保持完好。内部生长的肿瘤在结构上与供者的肿瘤相似，可见低钙化的恶性类骨质，间质细胞高度多态，可见有丝分裂像，少量软骨瘤区，间质细胞小而深染。在异种移植物中观察到相当丰富的血管供应，但无毛细血管扩张区。裸鼠身上形成的移植瘤免疫组化结果显示p53阳性、Ki67阳性、CD117阴性、Bcl-2阳性、Bcl-4阳性，与原发于患者的肿瘤相同，证明移植瘤很好地保留了原发肿瘤的生物学性状。

A为人骨肉瘤病理切片；B为裸鼠原位移植骨肉瘤切片。

从左到右依次为p53阳性、Ki67阳性、CD117阴性、Bcl-2阳性、Bcl-4阳性。

3 讨论

骨肉瘤是最常见的原发骨肿瘤，治疗的策略是基于新辅助化疗、延迟切除和根据手术中切除的肿瘤组织评估的组织学进行辅助化疗[15]。尽管在过去的25年，手术技术有了很大的进步，化疗方案也有了不同的发展，但5 a后的存活率仍保持在55%～70%[16-17]。为了继续提高对这种疾病的认识和测试新的治疗方法，需要在时间、生理和组织水平上准确再现人类病理的动物模型。

骨肉瘤动物模型可以分为自发型、诱导型、肿瘤移植和基因工程，最常用的仍是肿瘤移植造模，其他模型由于存在成瘤时间长、发病率低、稳定性差、均一性差等缺点而受到限制[18]。肿瘤移植通过将肿瘤组织块或细胞株移植到动物模型体内，形成与原发肿瘤相同的肿瘤，再把肿瘤移植到下一代，从而构建动物模型[19-20]。现在多用于肿瘤成瘤、治疗、浸润、转移等方面的实验研究。然而已建立的细胞系可能代表不了人类肿瘤的遗传异质性，无法使用真正的原始细胞建立真正的原位模型[21]。来源于患者的骨肉瘤动物模型优于传统的细胞系-异种移植模型，保持了与原代肿瘤更多的相似性[22-23]。

本研究结果表明，人骨肉瘤裸鼠胫骨移植瘤能持续、快速局部生长，侵袭周围组织，并能自发转移到肺，与Crnalic 等[24]的研究结果相似，然而Kimura等[10]认为大多数人骨肉瘤细胞系不会致瘤，在裸鼠体内也无转移能力。这可能是由于将人骨肉瘤组织在裸鼠皮下进行连续传代过程中进行了更具侵袭性的克隆，更适应在裸鼠体内生长，逐渐增加了异种移植的成瘤率。目前大多数研究主张使用低传代次数(<10次)的人源肿瘤异种移植模型来保留肿瘤的遗传完整性[14]。本研究采用第3代异种皮下移植物进行原位移植获得的肿瘤组织不仅与人骨肉瘤原始组织相似，而且保留了原始肿瘤的特征。

通过组织块移植法，将肿瘤碎片置入裸鼠的胫骨髓腔内，能够使其获得类似于人类肿瘤生长的微环境和多种促进肿瘤生长的内源性生长因子，在相对较短的时间内肿瘤就在局部生长并产生了自发转移。相较于细胞悬浮液法原位移植，不仅避免了打破细胞-细胞之间的联系和破坏人类肿瘤组织的原始结构导致原发肿瘤的性质和生物学行为的改变[25]，而且不会产生骨内压力，导致肿瘤细胞扩散到周围组织和循环中。通过这种方式，可以更好地模仿肿瘤体内自发转移的过程，如局部肿瘤的生长和侵袭。这也表明了骨环境的生长刺激和肿瘤细胞间的相互作用对肿瘤的摄取率和局部生长以及骨肉瘤的转移都是十分重要的。

本文通过肿瘤块移植法建立了骨肉瘤动物模型，成功构建了人源性骨肉瘤动物模型，进一步验证了这种造模方式的可行性，为骨肉瘤的进一步研究、治疗等奠定了基础。