基于食管鳞癌奥沙利铂耐药细胞测序差异表达分析

董慧玲，刘祥辰，孔鹏洲，徐恩伟，宋彬

1.山西医科大学第一医院，山西 太原 030001；2.中山大学附属第五医院，广东 珠海 519000；3.山西医科大学医学转化中心，山西 太原 030001；4.山西省肿瘤医院，山西太原030001；5.山西医科大学白求恩医院，山西 太原 030001

我国是食管癌高发国家，其中食管鳞癌（esophageal squamous cancer，ESCC）是食管癌的主要病理学类型，占90%以上［1］。随着医学技术的进步，ESCC治疗取得很大的进展，但晚期ESCC 的5年生存率仍很低［2-3］。化疗是晚期ESCC 的主要治疗手段［4-5］，食管癌诊疗指南（2020版）将铂类联合氟尿嘧啶类或紫杉醇类作为ESCC 的一线化疗方案。治疗食管癌常用铂类化疗药主要有顺铂（cisplatin，DDP）、奥沙利铂（oxaliplatin，OXA、L-OHP）、卡铂（carboplatin，CBP）等，随着铂类药物在临床上的广泛应用，越来越多的食管癌患者表现出对铂类药物的耐药［6］。

本研究建立了ESCC L-OHP耐药细胞株，通过全转录组测序技术筛选差异表达基因和富集的可能信号通路，旨在探索食管癌L-OHP耐药性的可能机制，为临床ESCC的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞 人食管鳞癌细胞系KYSE150细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 主要试剂及仪器L-OHP 为齐鲁制药有限公司生产；基础培养基RPMI1640购自美国Hyclone公司；胎牛血清（FBS）购自以色列BI公司；CCK-8试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；RNA提取试剂、逆转录及qRCR 试剂SYBRGreenl 购自宝生生物科技有限公司；Matrigel 胶购自美国BD Biscience 公司；Transwell小室为美国Corning公司产品。

1.3 细胞培养 将-80 ℃冻存的细胞取出，置于37 ℃温水中迅速解冻，225×g离心3 min，弃上清，用含10%FBS的RPMI1640完全培养基重悬细胞，均匀铺于小皿中，置37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养。

1.4 耐药细胞培养及形态学变化 L-OHP 分子量为397.29 g／mol，浓度范围0 ～200 μmol／L。用12.58 mL三蒸水溶解50 mg L-OHP，配制成浓度为10 mmol／L的母液，分装，100 μL／管，-80 ℃密封储存。分别将母液稀释成2、4、8、16、32、64、128、200 μmol／L的稀释液，CCK-8 法测定半数抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50）。用16 μmol／L 的L-OHP 冲击KYSE150 细胞24 h，去除含药培养基，PBS 洗去死细胞后换成新鲜完全培养基，细胞恢复正常生长速度，再用药物浓度递增方式诱导，直至细胞在16 μmol／L的L-OHP浓度下稳定传代即建成KYSE150／L-OHP细胞。每隔一段时间测定KYSE150和KYSE150／L-OHP组细胞的IC50值，并按下式计算耐药指数（resistance index，RI）。光学显微镜下观察KYSE150和KYSE150／L-OHP组细胞形态。

RI=L-OHP组耐药细胞IC50／亲本细胞IC50

1.5 细胞抑制率测定 将KYSE150 及KYSE150／LOHP 细胞用胰酶消化为单个细胞，225 ×g离心后，用培养基重悬细胞沉淀，并计数。将各组细胞以4 000个／孔接种于96孔板中，每组设5个复孔，培养24 h；试验组分别加入含不同浓度L-OHP 的完全培养基，对照组不加L-OHP，培养48 h；每孔加入10%CCK-8 试剂，作用2 h，酶标仪检测450 nm 波长处各孔吸光度值，并按下式计算药物对细胞的抑制率。

抑制率（%）=（对照组A450-试验组A450）／（对照组A450-空白组A450）×100%

1.6 细胞侵袭／迁移能力的检测

1.6.1 侵袭试验 采用Transwell小室试验。提前24 h将BD Matrigel 胶置4 ℃融化，与基础培养基按1∶7稀释，每个小室中加入100 μL，置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养；取各组细胞沉淀，用基础培养基重悬并计数，在24 孔板的下室加入600 μL 含10%FBS的完全培养基，上室加入200 μL 细胞悬液（8 × 104个细胞），置于恒温培养箱中培养24 h；用棉签将小室里面底部的细胞擦净，放入4%多聚甲醛中固定20 min，三蒸水洗涤1 次，用结晶紫染色30 min，显微镜下观察，随机选取4 ～6个视野拍照计数。

1.6.2 迁移试验 除小室不铺基质胶，其余步骤同1.6.1项。

1.7 转录组测序及差异表达基因筛选 RNA 提取、文库构建、质控由中国北京诺禾致源科技有限公司（简称诺禾致源）完成。文库检测合格，将各组文库按照有效浓度及目标数据汇集后进行Illumina 测序［7］。本研究采用诺禾致源illumina HiSeqTM2500／MiSeq 等测序平台对KYSE150 和KYSE150／L-OHP细胞进行测序［8］。利用edgeR 分析软件对miRNA、LncRNA、circRNA、mRNA表达谱数据均一化后，进行组间差异基因表达分析。用差异倍数（fold change）≥2倍，P值或矫正后的P值判断显著性水平，校正后的P值越小代表越显著。将P＜0.05 作为差异显著性标准（若P＜0.05 筛选差异过少，则使用q＜0.05 进行差异筛选，筛选条件见火山图）。为探究差异表达基因的功能，通过KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库来寻找这些差异基因主要参与的信号通路。使用KOBAS（2.0）进行pathway 富集［9］，FDR ≤0.05 的pathway 定义为在差异表达基因中显著富集的pathway。

1.8 差异表达基因的RT-PCR 验证 为验证所筛选的差异表达基因的准确性，从中选取5 个差异倍数相对较大的基因进行RT-PCR 验证。提取细胞总RNA，使用Prime Script TMRT Master Mix（Perfect Real Time）试剂盒（北京聚合美生物科技有限公司产品）将RNA 反转录为cDNA，体系为20 μL。利用在线引物设计工具Oligo设计qRCR特异性扩增引物，GAPDH正义链：5′-CCAGAACATCATCCCTGCCT-3′，反义链：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′；ACTG1正义链：5′-CATTGTCATGGACTCTGGAGAC-3′，反义链：5′-GAGGATCTTCATGAGGTAGTCG-3′；CKM正义链：5′-AGAGTCCTGCTCCCTCACTC-3′，反义链：5′-AGGATGGAGCCCATTGGTTG-3′；CCL3正义链：5′-TGCCCTTGCTGTCCTCCTCTG-3′，反义链：5′-GGCTGCTCGTCTCAAAGTAGTCAG-3′；HNRNPH1正义链：5′-CAGTTCAGCGACCACGTTTG-3′，反义链：5′-CACCACGAATCCCTCTCCAC-3′；STAT1正义链：5′-TCTGTGTCTGAAGTTCACCCT-3′，反义链：5′-ACAGAGCCCACTATCCGAGA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以对照组管家基因GAPDH为内参照，采用△△Ct法计算目的基因相对表达量。

1.9 统计学分析 使用SPSS 20.0 软件进行统计分析。采用T检验和单向方差分析比较正态分布的测量数据，秩和检验比较非正态分布的测量数据。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 细胞的IC50及耐药性 KYSE150／L-OHP 细胞的IC50［（74.6 ±4.43）μmol／L］明显高于KYSE150 细胞［（18.65 ±3.35）μmol／L］（t= 22.9，P＜0.01）。KYSE150／LOHP对L-OHP的耐药指数为（4.0±1.35）。见图1。

图1 L-OHP 对KYSE150 和KYSE150／L-OHP 细胞的抑制率Fig.1 Inhibition rate of L-OHP on KYSE150 and KYSE-150／L-OHP cells

2.2 KYSE150／L-OHP 细胞的形态学变化 显微镜下观察显示，KYSE150 细胞形态清晰，呈梭形；与亲代细胞相比，KYSE150／L-OHP 细胞大小不一，体积增大，形态不规则，个别细胞出现崩解、细胞核碎裂、固缩。见图2。

图2 KYSE150（A）和KYSE150／L-OHP（B）细胞形态的显微镜观察（×200）Fig.2 Microscopy of cell morphology of KYSE150（A）and KYSE150／L-OHP（B）（×200）

2.3 KYSE150／L-OHP细胞侵袭／迁移能力的变化 与亲本KYSE150细胞相比，耐药细胞KYSE150／L-OHP的侵袭和迁移能力均显著增强（t分别为25.49 和46.05，P均＜0.000 1），见图3和表1。

表1 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 细胞侵袭／迁移能力的差异（±s，n=3）Tab.1 Difference of cell invasion or migration ability of KYSE-150 and KYSE150／L-OHP（±s，n=3）

表1 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 细胞侵袭／迁移能力的差异（±s，n=3）Tab.1 Difference of cell invasion or migration ability of KYSE-150 and KYSE150／L-OHP（±s，n=3）

细胞KYSE150 KYSE1150／L-OHP侵袭细胞数61.67±2.73 164.3±2.96迁移细胞数102.7±1.45 263.7±3.18

图3 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 细胞侵袭／迁移能力的比较（结晶紫染色，×200）Fig.3 Comparison of cell invasion or migration ability of KYSE150 and KYSE150／L-OHP（crystal violet staining，×200）

2.4 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 差异表达基因筛选 为探索ESCC L-OHP 耐药细胞的耐药机制，对耐药细胞及其亲代细胞进行了全转录组测序并筛选差异表达基因。KYSE150 和KYSE150／L-OHP（分别对应150NC 和150RS）miRNA 水平最终获得45 个差异性表达基因，其中31 个基因在150RS 中表达上调，14 个基因在150RS 中表达下调，见图4A；circRNA 水平最终获得514 个差异性表达基因，其中229 个基因在150RS 中表达上调，285 个基因在150RS 中表达下调，见图4B；LncRNA 水平最终获得24 个差异性表达基因，其中21 个基因在150RS 中表达上调，3 个基因在150RS 中表达下调，见图4C；mRNA 水平最终获得408 个差异性表达基因，其中256 个基因在150RS 中表达上调，152 个基因在150RS中表达下调，见图4D。

图4 KYSE150和KYSE150／L-OHP差异基因表达火山图Fig.4 Volcano map of differential gene expression of KYSE-150 and KYSE150／L-OHP

2.5 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 差异表达基因KEGG 功能注释 miRNA 水平差异表达基因显著富集在磷脂酰肌醇、嘌呤代谢、PI3K／AKT／mTOR 和MAPK 等信号通路，见图5A；circRNA 水平差异表达基因富集在转录水平、紧密连接、内质网中的蛋白质加工、泛素介导的蛋白水解等相关信号通路，见图5B；LncRNA 水平差异表达基因富集在趋化因子信号通路、溶酶体、细胞因子受体相互作用等相关信号通路，见图5C；mRNA 水平差异表达基因富集在癌症相关途径、局灶性黏附信号通路、Hippo 信号通路、ECM-受体相互作用以及脂肪酸代谢等相关信号通路，见图5D。

图5 KYSE150和KYSE150／L-OHP差异表达基因KEGG注释Fig.5 KEGG function annotation of differentially expressed genes of KYSE150 and KYSE150／L-OHP

2.6 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 差异表达基因的验证 5 个差异倍数相对较大的基因ACTG1、CKM、CCL3、HNRNPH1、STAT1均在L-OHP 耐药细胞中高表达，其中CCL3、STAT1表达远高于其他基因，差异有统计学意义（t分别为47.62 和7.47，P均＜0.001），见图6。

图6 KYSE150和KYSE150／L-OHP差异表达基因的RTPCR验证Fig.6 RT-PCR verification of differentially expressed genes of KYSE150 and KYSE150／L-OHP

3 讨论

由于ESCC 早期症状不明显和缺乏早期诊断分子标志物，50%的患者确诊时已处于中晚期，失去了最佳治疗时机。部分患者只能给予局部放射治疗或全身化学治疗、靶向治疗与免疫治疗［10］。全身化学治疗是大部分晚期ESCC患者的首选治疗方式，但原发性耐药和获得性耐药往往导致治疗失败。因此，急需寻找特异性的分子标志物来预测ESCC 治疗疗效及是否耐药，为ESCC的治疗提供指导。

本研究建立ESCC L-OHP 耐药细胞株后进行全转录本测序，通过差异表达基因筛选和通路富集进一步探索L-OHP耐药的分子机制。根据差异表达基因筛选结合文献发现，EBNA2 通过CCL3 和CCL4 介导的NF-κB 和Btk 激活来指导B 细胞淋巴瘤对阿霉素的耐药性［11］。CCL3基因可能与癌症耐药相关，对细胞的增殖、侵袭、迁移等均有影响，并参与免疫应答，可作为后续研究的靶分子。差异表达基因在KEGG数据库功能注释结果显示，参与耐药通路有P13KAkt、MAPK、Hippo 信号通路［12-14］。越来越多的证据表明，PI3K／AKT 途径与癌细胞的耐药性有关［15-17］。如WANG 等［18］证明，分泌型簇蛋白通过肝细胞癌中的Gadd45a／PI3K／Akt 信号通路介导L-OHP耐药；LI 等［19］证明，ATXN2L 可由EGF 通过PI3K／Akt 信号传导上调，促进细胞侵袭性和L-OHP 抗性；LIAO等［20］证明，正反馈激活CCN2-MAPK-Id1 信号能显著促肝癌L-OHP 耐药。Hippo 信号的失活使癌细胞对各种类型的癌症化学治疗药物具有抗性。Hippo 信号通路在人类多种癌症中均失调，且在肿瘤发生和发展中起着至关重要的作用［21］。Hippo 途径的失活将未磷酸化的YAP 入细胞核，诱导与细胞生长相关基因的转录［22］。TFAP2C 通过转录激活Hippo 信号传导的负调控因子ROCK1和ROCK2促进CSCs特征和化疗耐药，导致结肠直肠癌细胞中Hippo 信号的失活［23］。

综上所述，本研究成功构建了ESCC L-OHP耐药细胞模型，并通过全转录本测序技术初步筛选出耐药前后差异表达的基因，经过通路富集及生物信息学分析，探讨了耐药可能发生的分子机制，为寻找L-OHP耐药的新型分子标志物和治疗靶点提供了思路。