壮药羊开口的化学成分研究

刘立辉 邹 准 周艳林 钟小清 吕高荣 周志宏 邹节明*

1.桂林三金药业股份有限公司，广西 桂林 541004；2. 云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500

壮药羊开口为野牡丹科(Melastomaceae)野牡丹属(MelastomaL.)植物展毛野牡丹MelastomanormaleD.Don的干燥根，为广西壮医药习用药材，收载于《广西壮族自治区壮药质量标准(第一卷)》，壮药名为棵芒难，味甘、酸、涩，微温，具有收敛、止血、解毒的功效，用于泄痢、崩漏带下、内外伤出血[1]。现代药理研究[2]表明，羊开口提取物对艾滋病毒逆转录酶和DNA多聚酶活性具有抑制作用。羊开口是中成药三金片系列产品的重要原料之一，目前关于羊开口化学成分的研究报道并不多，报道的化学成分主要包括β-谷甾醇、鞣花酸、没食子酸及其衍生物等少数化合物[3]。文献[4]报道从展毛野牡丹分离得到一些酚类化学成分，但该化学成分的种类依然还是没食子酸衍生物和少量的酚苷类化合物。因此，为进一步认识羊开口的化学成分，明确相关活性与药用物质基础，本实验对羊开口的化学成分进行了研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV2401PC型紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)；Finnigan MAT-90型质谱仪(美国Finnigan公司)；Bruker AM-400和DRX-500核磁共振仪(德国Bruker公司，TMS为内标)； XP 205电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；MILLI-Q密理博超纯水仪(德国Merck公司)；LC-20A型岛津半制备高效液相色谱仪(日本岛津公司)；RE-2000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；CCA-1112A冷却水循环装置(上海爱郎仪器有限公司)；WFH-201B暗箱式紫外透射反射仪(上海精科实业有限公司)。

1.2 材料 柱色谱硅胶(200～300目)和薄层层析硅胶板G(青岛海洋化工厂)；反相C18填料(40～60 μm)(日本Fuji公司)；MCI CHP-20(75～150 μm)(日本Mitsubishi Chemical公司)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；提取用乙醇为市售食品级，其余化学试剂均为市售色谱纯或分析纯。羊开口采自广西桂林市永福县，其原植物经中国科学院广西植物研究所蒋水元研究员鉴定为展毛野牡丹MelastomanormaleD.Don。植物标本存放于桂林三金药业股份有限公司企业技术中心。

2 提取和分离

羊开口干燥根10 kg，粉碎后加75%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，滤过，滤液合并浓缩成浸膏加水混悬，静置，出现大量沉淀，滤过，得沉淀(87 g)，滤液用等体积三氯甲烷萃取3 次，三氯甲烷萃取液合并浓缩得到三氯甲烷萃取部位浸膏(11 g)。将三氯甲烷萃取部位浸膏与前所得沉淀分别取样加适量溶剂溶解，通过在TLC上用相同溶剂系统展开对比，三氯甲烷萃取部位浸膏色谱中，在与前所得沉淀色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。将三氯甲烷萃取部位浸膏与前所得沉淀合并，经硅胶柱色谱(石油醚-丙酮梯度、三氯甲烷-甲醇梯度)洗脱，合并得到5 个组分(Fr.1～Fr.5)。Fr.2(40 g)经硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇梯度)洗脱，合并得到2 个组分(Fr.2.1～Fr.2.2)。Fr.2.1(2g)经硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇梯度)反复洗脱、MCI 柱色谱(甲醇-水梯度)洗脱，最后经重结晶，得化合物Ⅱ(63 mg)和Ⅵ(66 mg)；Fr.2.2(3g)经硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇梯度)反复洗脱，再经重结晶，得到化合物Ⅰ(220 mg)。Fr.4(20 g)经硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇梯度)洗脱，合并得到3 个组分(Fr.4.1～Fr.4.3)。Fr.4.3(1g)经硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇梯度)反复洗脱、反相C18柱色谱(甲醇-水梯度)洗脱，最后经重结晶，得到化合物Ⅲ(10 mg)和Ⅴ(77 mg)。三氯甲烷萃取剩余水层经MCI 柱色谱(甲醇-水梯度)、硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇梯度)、Sephadex LH - 20 柱色谱(甲醇-水梯度)洗脱，最后经重结晶，得到化合物Ⅳ(45 mg)。

3 结构鉴定

化合物Ⅰ：白色粉末(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):198，246。ESI-MS m/z：599 [M+Na]+，分子式为C35H60O6。1H-NMR (DMSO) δ:5.32(1H,s,H-6)，4.90(1H,d,J=8.0 Hz,H-1)，4.42(1H,t,H-3)，0.93(3H,s,H-19)，0.65(3H,s,H-18);13C-NMR (DMSO) δ:140.9(C-5)，121.7(C-6)，101.3(C-1′)，77.4(C-5′)，77.4(C-3)，77.2(C-3′)，73.9(C-2′)，70.6(C-4′)，61.6(C-6′)，56.6(C-14)，55.9(C-17)，50.1(C-9)，45.6(C-24)，42．3(C-13)，40.6(C-4)，39.4(C-16)，37.3(C-1)，36.7(C-10)，36.7(C-20)，33.8(C-22)，31.9(C-7)，31.8(C-8)，29.7(C-2)，29.2(C-12)，28.3(C-25)，25.9(C-28)，24.3(C-15)，23.1(C-23)，21.1(C-26)，20.2(C-27)，19.6(C-11)，19.4(C-21)，19.1(C-19)，12.2(C-29)，12.2(C-18)。以上数据与文献[5]报道的胡萝卜苷数据基本一致，故鉴定该化合物为胡萝卜苷。

化合物Ⅱ：白色针晶(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):246。 EI-MS m/z：455 [M-H]-，分子式为C30H48O3。1H-NMR (C5D5N) δ:4.95, 4.76(each 1H, m, CH2-29 ), 3.45(1H, m, H-3 ), 1.77, 1.21, 1.07, 1.06, 1.01, 0.83(each 3H,s,CH3×6);13C-NMR (C5D5N) δ:178.6 (C-28), 151.1(C-20), 109.7(C-29), 77.9 (C-3), 56.4 (C-17), 55.7(C-5), 50.7(C-9), 49.5(C-19), 47.5(C-18), 42.6(C-14), 40.9(C-8), 39.3(C-4), 39.0(C-1), 38.4(C-13), 37.3(C-10), 37.3(C-22), 34.6(C-7), 32.6(C-16), 31.0(C-15), 30.0(C-21), 28.4(C-23), 28.1(C-2), 25.9(C-12), 21.0(C-11), 19.2(C-30), 18.5(C-6), 16.1(C-24), 16.2(C-25), 16.2(C-26), 14.7(C-27)，以上数据与文献[6]报道的白桦脂酸数据基本一致，故鉴定该化合物为白桦脂酸。

化合物Ⅲ：柱状晶片(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):246，364。EI-MS m/z：491 [M-H]-，分子式为C22H20O13。1H-NMR (DMSO) δ:7.78(1H, s,H-5′), 7.49(1H, s,H-5), 5.12(1H, d,J=9.0 Hz,H-1″), 4.04(3H, s,OCH3-3′), 4.00(3H, s,OCH3-3);13C-NMR (DMSO) δ:158.3(C-7 and 7′), 152.8(C-4′), 151.5(C-4), 141.8(C-3′), 141.6(C-3), 140.9(C-2′), 140.2(C-2), 114.1(C-1), 112.7(C-6), 111.9(C-5), 111.8(C-5′), 111.6(C-6′), 111.1(C-1′), 101.4(C-1″), 77.2(C-5″), 76.5(C-3″), 73.3(C-2″), 69.5(C-4″), 60.5(C-6″), 61.6(3-OCH3), 60.9(3′-OCH3)。以上数据与文献[7]报道的3,3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷数据基本一致，故鉴定该化合物为3,3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物Ⅳ：白色粉末(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):246, 364。ESI-MS m/z:529 [M+Na]+，分子式为C23H22O13。1H-NMR (C5D5N) δ:8.47(1H, s, H-5′), 7.82(1H, s, H-5), 5.93(1H, d,J=7.8 Hz, H-1″), 4.25, 4.15(6H, s, 3,3′-2 × OCH3), 3.87(3H, s, 4′-OCH3);13C-NMR (C5D5N) δ:158.8(C-7), 158.6(C-7′), 154.8(C-4′), 152.8(C-4), 142.6(C-3), 141.8(C-2), 141.8(C-2′,3′), 113.9(C-1), 113.3(C-6), 113.1(C-1′), 113.1(C-5), 112.6(C-6′), 108.0(C-5′), 102.7(C-1″), 78.9(C-2″), 78.31(C-3″), 74.6(C-4″), 70.86(C-5″), 62.10(C-6″)，61.7(3-OCH3), 61.3(3′-OCH3), 56.4(4′-OCH3)，以上数据与文献[8]报道的3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷数据基本一致，故鉴定该化合物为3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物Ⅴ：浅黄色晶体(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):274。分子式为C8H8O5。1H-NMR (MeOD) δ:7.06(2H,s), 3.83(3H, s);13C-NMR (MeOD) δ:169.1(C-7), 146.4(C-3,5), 139.8(C-4), 121.4(C-1), 110.1(C-2,6)。以上数据与文献[9]报道的没食子酸甲酯数据基本一致，故鉴定该化合物为没食子酸甲酯。

化合物Ⅵ：针状晶体(甲醇)，通过在TLC上用3种溶剂系统展开对比，与没食子酸对照品斑点颜色及Rf值均一致，故鉴定为没食子酸。

4 讨论

研究从羊开口的乙醇提取物中分离鉴定了6个化合物，包括1个甾体类化合物，1个三萜类化合物，2个鞣酸类化合物，2个酚酸类化合物，进一步证实了可水解鞣酸类成分为本属植物的特征性成分之一[10]。

文献[11]报道，胡萝卜苷具有良好的抗肿瘤、抗氧化以及保护神经等药理作用。白桦脂酸具有一定的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化应激、抗炎等药理活性，尤其是在抗肿瘤、抗HIV、抗黑色素瘤方面，展现出良好的开发前景。白桦脂酸通过抑制COX-2介导的NF-κB和ERK1/2通路抑制丙肝病毒复制，可作为一种治疗HCV感染患者潜在的药物开发先导化合物[12]。鞣花酸苷类物质3,3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在1～500 μg·mL-1质量浓度范围内对人胃癌MGC细胞、人肝癌HepG-2细胞、人盲肠癌Hce-8693细胞增殖均有一定的抑制作用，随着剂量的增大和作用时间的延长，呈较好的剂量-时间-效应关系[13]。没食子酸甲酯具有一定的抗氧化活性，其IC50值为8.99 μmol·L-1[14]。没食子酸甲酯还可以通过抑制Akt和ERK1/2磷酸化，抑制胶质瘤细胞的生长和迁移，显示出一定的抗肿瘤作用[15]。没食子酸具有一定的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎作用等。没食子酸可以抑制促细胞炎性因子肿瘤坏死因子、白介素-6和白介素-1的分泌，间接抑制革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖诱发炎性反应[16]。

根据研究分离得到的化学成分及相关活性报道，初步证实了羊开口具有一定的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗炎的活性物质基础，同时也初步证实了羊开口的收敛、止血、解毒的中医功效以及泄痢、崩漏带下、内外伤出血的临床应用具有一定的合理性，为完善羊开口的药效物质基础及进一步的研究开发提供了理论依据。关于该植物更多的化学成分和深入的药理作用机制仍有待更进一步的研究。