内皮细胞能量代谢与病理性血管生成

李 洋，周媛媛，夏思伟，陈 利，杨 婷，张 峰，郑仕中

(南京中医药大学江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023)

1 血管生成概述

血管是生物运送血液的管道，在为机体提供氧气和营养的同时，也为免疫监视提供通道。血管遍布所有组织器官，其结构或功能性血管异常将会引发多种疾病。血管维持或生长不足会导致神经退行性疾病、心肌梗死或局部缺血性疾病，血管的过度生长或结构异常也会导致许多疾病的发生，包括癌症、炎症性疾病和动脉高压等[1]。近年来，血管生成越来越多地被描述为原始血管网生长和再塑形成复杂网络的过程，该过程包括基底膜被蛋白溶解，细胞外基质的蛋白水解、内皮细胞迁移和增殖、细胞外基质的产生、血管管腔形成以及新生血管吻合成网等关键步骤[2]。其复杂的形成过程导致血管的形成与发展易受多种因素的影响，包括促血管生成因子：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素(angiopoietins)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)等[3]，血管生成抑制因子如内皮抑素、血管抑制素和TNP-470(烟曲霉素的类似物，一种抗血管生成药物)等，除此外还包括炎症因子、内皮代谢[4]等。内皮代谢在血管生成中的作用举足轻重，内皮细胞(endothelial cells，ECs)需协调细胞新陈代谢，使代谢通量适应分支血管不断增加的能量和生物量需求[4]。因此，从内皮能量代谢入手寻找病理性血管生成的解决方法具有重要意义。

2 内皮代谢与病理性血管生成

2.1 内皮糖代谢与病理性血管生成ECs单层覆盖于血管内壁上，是血流和周围组织间营养和氧气交换所必需的。在病理性血管生成的刺激反应中，内皮细胞将从静止状态迅速转变为增殖和迁移状态，而内皮细胞独特的糖酵解特性对细胞增殖、迁移和对环境变化的反应至关重要[5]。糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)是内皮细胞的两个主要能量产生途径，但通常情况下，在血管新生期间，约85%的三磷酸腺苷(ATP)是通过人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的糖酵解途径产生的[6]。与无氧糖酵解(即在缺氧下发生的糖酵解)不同，有氧糖酵解可绕过线粒体OXPHOS，促进葡萄糖水解速率的增加，加快供能速率，因此病理性的血管生成更依赖于有氧糖酵解提供能量。

有氧糖酵解产生的丙酮酸可以通过介导VEGF和纤溶酶原激活物抑制剂-1在肝癌细胞中的转录来诱导缺氧诱导因子-1α的表达并加速血管生成过程[7]。丙酮酸激酶M2(PKM2)是调节有氧糖酵解最后一步的关键酶，Ren等[8]通过管形成试验、伤口愈合试验、细胞侵袭实验发现评估PKM2对血管生成的作用，并通过蛋白质印迹分析、流式细胞术、线粒体膜电位检测、活性氧检测、免疫荧光染色和定量实时聚合酶链反应来研究PKM2调节血管驻留内皮祖细胞血管生成的潜在机制，发现PKM2的激活可以通过调节糖酵解、线粒体裂变和融合来促进血管驻留内皮祖细胞的增殖和血管生成分化。Den等[9]通过IHC染色检测皮下肿瘤中Dickkopf相关蛋白2(DKK2)和内皮转录因子的表达，发现内皮转录因子和微血管的形成与DKK2的表达呈正相关，进一步研究发现DKK2通过有氧糖酵解从葡萄糖中产生乳酸并在肿瘤微环境中积累，并且可以与葡萄糖摄取所需的脂蛋白受体相关蛋白6协同作用，激活下游的mTOR信号通路，进一步加速乳酸分泌，而乳酸作为DDK2的最终执行者刺激内皮细胞的管形成从而促进肿瘤的血管生成。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶(PFKFB3)是内皮细胞糖酵解的关键酶，其能够对ECs的多种细胞发生过程产生影响并最终影响血管生成：PFKFB3能够更快地产生ECs增殖所需的能量并促进葡萄糖的吸收，从而为血管的发芽行为实现更多的能量产生；高水平的核PFKFB3促进ECs的生长，对维持ECs的细胞状态具有重要的帮助作用；PFKFB3的沉默会降低糖酵解通量，损害尖端细胞的竞争力和茎细胞增殖，ECs中丝状伪足和片状伪足的形成也会受到损伤等[10]。

许多药物治疗血管生成相关疾病的机制也与有氧糖酵解紧密相关。白藜芦醇通过调节ERK介导的PKM2核易位降低葡萄糖转运蛋白1、磷酸果糖激酶-1、己糖激酶2和PKM2等有氧糖酵解关键酶活性来抑制人内皮细胞的血管生成[11]。斑蝥素通过降低细胞外酸化率，增加高转移细胞的耗氧率抑制有氧糖酵解，从而显著抑制了血管生成的侵袭[12]。以上结果均表明，有氧糖酵解在病理性血管生成发生、发展中扮演重要角色，并且通过药理学手段削弱有氧糖酵解过程相关因子的表达，对血管生成相关疾病起到明显的治疗作用。因此，进一步以有氧糖酵解为切入点探究病理性血管生成治疗药物具有重要意义。

2.2 内皮氨基酸代谢与病理性血管生成内皮细胞的代谢被认为是血管生成的驱动力，尽管有氧糖酵解在血管生成过程中至关重要，但它不是唯一的代谢决定因素，最近的研究表明，除了糖酵解和脂肪酸氧化外，内皮细胞还依赖特定的氨基酸来增殖、迁移和存活，因此氨基酸代谢在调节和维持血管功能方面也发挥着重要作用[13]。高水平的不对称二甲基精氨酸(ADMA)是损害血管生成的重要因素。据报道，小鼠体内ADMA的缺乏强烈诱导了血管生成，而心肌营养素-1的过度表达对ADMA的抑制导致内皮细胞迁移和增殖以及血管形成的增加[14]。羟脯氨酸是动物体内结构和生理上重要的亚氨基酸，其转化生成的甘氨酸除了促进谷胱甘肽、DNA、血红素和蛋白质的产生外，还能够抑制血管内皮生长因子介导的内皮细胞增殖，对血管生成产生负面作用[13，15]。L型氨基酸转运蛋白1(LAT1)介导的氨基酸转运是支持体外内皮细胞增殖和翻译起始的基础，Quan等[16]在小鼠肿瘤模型中观察到高内皮LAT1表达。通过废除LAT1的功能或抑制其表达后发现体内外的血管生成受到抑制。此外，LAT1是VEGF-A依赖性迁移、侵袭、管形成所必需的，这表明内皮细胞中促血管生成信号传导和能量代谢之间存在交互作用。

谷氨酰胺(glutamine，Gln)代谢在血管生成中的作用更加丰富。Gln提供ECs的三羧酸循环中的大部分碳，并通过还原羧化作用促进脂质生物合成。Kim等[17]发现，在细胞培养中，Gln剥夺或谷氨酰胺酶的抑制会阻止ECs增殖，谷氨酰胺酶在小鼠EC中的特异性缺失显著减弱了血管生成。由基因 GLUL编码的谷氨酰胺合成酶是一种将谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺的酶，它由内皮细胞表达。Eelen等[18]在小鼠中发现，内皮细胞中Glul的基因缺失会损害血管发育过程中的血管萌发，而谷氨酰胺合成酶的药理学阻断抑制眼部和炎症性皮肤病中的血管生成。Gln是内皮细胞消耗最多的一种氨基酸，内皮细胞通过Gln产生的谷胱甘肽(glutathione，GSH)用于氧化还原稳态，Gln的耗竭使内皮细胞容易受到活性氧诱导的损伤，以川芎嗪-桦木酸衍生物(BA-12)为例。Cui等[19]基于UPLC-QTOF-MS的靶向代谢组学和药理学实验，检测了GSH代谢相关指标以验证BA-12治疗血管生成的主要机制，发现检测样品中γ-谷氨酰转移酶、谷胱甘肽还原酶和磷脂酶A2的活性显著升高，而γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性没有显著变化，表明BA-12导致GSH代谢的激活，过氧化产物的增加和抗氧化指标的显著降低表明氧化还原平衡受到进一步影响，二者共同导致了血管生成的抑制。Gln分解代谢产生的谷氨酸可以转化为鸟氨酸，产生促血管生成因子，如一氧化氮和多胺[20]。谷氨酰胺缺失或抑制谷氨酰胺合成酶会由于增殖和迁移受损而导致血管发芽缺陷，减少病理性血管生成[21]。

2.3 内皮脂质代谢与病理性血管生成越来越多的证据表明内皮功能障碍与脂质代谢异常之间存在密切关系。Liang等[22]发现人微血管内皮细胞暴露于重金属镉(Cd)24 h后，内皮功能严重受损并最终导致了细胞的死亡。镉暴露通过破坏人微血管内皮细胞中的脂质代谢导致内皮功能障碍，具体表现为Cd加速了甘油三酯的分解并导致游离脂肪酸的积累，脂肪酸氧化受损进一步诱导了活性氧的产生和线粒体功能障碍，并最终导致了细胞死亡。脂质过载与影响细胞信号活动和内皮功能的内皮表观遗传状态的变化密切相关。Chen等[23]通过高脂饮食诱导小鼠脂质超负荷状态，发现与喂食正常食物的小鼠相比，高脂饮食诱导的肥胖小鼠表现出血管生成缺陷，具体表现为后肢缺血后血流恢复速度较慢、皮肤损伤后伤口愈合速度降低以及受伤的组织中毛细血管密度下降等。而通过过表达激活转录因子4增加了其与甲硫氨酸腺苷转移酶2A的结合，诱导赖氨酸甲基转移酶2A恢复因脂质过载导致的NOS3和ERK1基因调控区的H3K4甲基化水平的降低和血管生成信号的活性，改善了钝化的血管生成反应。以上结果表明，脂质过载环境导致内皮细胞相关血管生成信号的表观遗传状态改变，这为具有脂质超负荷的疾病如肥胖和糖尿病的血管并发症具有重要的潜在治疗意义。

由胆碱-乙醇胺磷酸转移酶1(CEPT1)介导的从头磷脂生成对于肝脏中过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα)等转录因子的磷脂激活至关重要。Zayed等[24]通过诱导VE-钙粘蛋白-他莫昔芬诱导型Cre重组酶介导的重组(Cept1Lp/LpCre+)构建了特异性缺失CEPT1的ECs，发现CEPT1的特异性缺失降低了ECs增殖、迁移和小管形成，且Cept1Lp/LpCre+小鼠缺血后肢的灌注和血管生成减少。其中机制包括CEPT1影响ECs中的PPARα磷酸化，PARα激动剂非诺贝特可以在Cept1减少的情况下挽救ECs功能、后肢灌注和PPARα激活表达证明了这一点。以上实验结果表明，参与磷脂生成的病理代谢途径在ECs功能和缺血性损伤后的恢复中发挥重要作用。

内皮细胞脂肪酸代谢也是影响病理性血管生成的代谢过程的重要部分。内皮细胞对脂肪酸代谢的利用与其他细胞不同，它需要从血液中被动扩散或运输脂肪酸进入细胞进行脂肪酸氧化[25]。摄取脂肪酸是细胞利用脂肪酸的第一步，也是代谢调节的关键节点[26]。在细胞内，非游离脂肪酸需与脂肪酸结合蛋白结合才能被转运至目的地。脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein 4, FABP4)是一种脂肪酸分子伴侣，在体内沉默FABP4后观察到了微血管密度的显著下降，机制研究发现FABP4的沉默抑制内皮芽体外伸长，VEGF和DLL4-Notch1信号通路的相互作用被扰乱，导致血管萌发和血管生成的减少[27]。肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)是脂肪酸代谢途径的限速酶，CPT1A的内皮损失通过增加内皮氧化应激促进EC功能障碍，Shi等[28]发现，对CPT1A进行药物阻断会损害中药丹气丸的促血管生成作用，证明了FAO在血管生成过程中发挥的关键作用。另外，ECs中的脂肪酸合酶缺失会引起丙二酰辅酶A水平升高，导致在赖氨酸1218处的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)丙二酰化，降低mTOR复合物1的活性，mTOR相关通路受阻，ECs增殖和血管发芽受到抑制，导致体内血管生成受到损害，且脂肪酸合酶阻断剂可减少病理性眼部新生血管形成[29]。IL-17A是调节肿瘤进展的关键细胞因子，Wang等[30]通过植入转染IL-17A表达载体或对照载体的人肺癌细胞株H460建立异种移植模型，观察IL-17A对HUVECs出芽和管腔形成的影响，发现IL-17A在体内和体外激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路促进FAO，增加内皮细胞的线粒体呼吸刺激H460肿瘤生长和新血管生成。

3 结语与展望

内皮细胞代谢是血管生成的关键调节因素，也是血管生成相关疾病的有效治疗靶点。在这里，我们列举和描述不同的代谢途径通过影响内皮细胞的功能进而对病理性血管生成进程起到决定性作用。事实上，内皮代谢远非简单地刺激细胞生长和迁移的教条观点，复杂的疾病环境对内皮细胞的影响是多层次的，不同血管床中EC具有异质性，转化为功能和表型的差异，因此来自不同组织的ECs的代谢不可一概而论，且内皮细胞的代谢也会通过细胞间通讯对其他细胞的正常功能产生影响。因此需要几种代谢途径与生长因子、遗传信号平行作用，以维持内皮细胞正常生物学行为。当内皮代谢紊乱使内皮细胞功能失调，并导致严重疾病时，这一概念变得更加重要。随着内皮糖酵解和脂肪酸代谢过程被开创性地转化为这些疾病的可能治疗途径，其他代谢途径在血管生成中作用的研究也逐渐引起了研究人员的关注。深入研究内皮代谢不仅能够为研发抗病理性血管新生的药物提供强有力的依据，同时对各种血管生成相关疾病的诊断、治疗提供有益的帮助，具有不可忽视的现实意义。