牛奶中β-内酰胺类药物检测研究进展

岳婷婷，闫磊, ，闫跃飞, ，高娜，任小丽，皇超英，潘磊，侯玉芳，张震,

（1.河南省奶牛生产性能测定有限公司，郑州 450000；2.河南省奶牛生产性能测定中心，郑州 450000）

β-内酰胺类药物(Beta-lactam)是一类广谱抗菌药，也是自然界发现最早的抗生素。其不仅包含青霉素类药物，还有头孢菌素类（四代）、单酰胺环类（氨曲南）、碳青霉烯类（亚胺培南）等，此类药物化学结构中均含有β-内酰胺环，是现有的抗生素中使用最广泛的一类。其抗菌机理为繁殖期杀菌药，对多数革兰氏阳性和阴性菌引起的疾病，如乳房炎、子宫内膜炎、口蹄疫、酮病、蹄病[1]、牛流行热等有很好的疗效，对各种螺旋体和放线菌疾病也有很强的抑制作用。随着奶牛养殖业的快速发展，市售乳制品种类也逐渐增加，随之而来的是一系列质量安全问题，其中，个别养殖户对药物的过度使用、非法添加、代谢残留等问题对奶业发展造成了一定的影响。因此，对牛奶中β-内酰胺类药物残留量进行监管很有必要。

1 β-内酰胺类药物在奶牛中的应用现状

Van Boeckel等[2]对2000年和2010年全球抗生素消费量的研究发现，β-内酰胺类药物在全国各地使用广泛且频繁。从2012-2017年抗生素销售量并对该数据进行监测分析发现，2012-2015年抗生素的总消费量从16.07DID增加到17.44DID（DID代表1 000名居民每天抗生素的消耗量），然后在2017年下降到11.35DID。其中青霉素是最常用的抗生素类，占总DID的36.32%[3]。

国内外有很多报道使用β-内酰胺类药物来治疗奶牛疾病，如靳菊贤使用480万单位青霉素钠辅以5g硫酸链霉素进行肌内注射来治疗牛流行性热[4]；章建喜等人分别通过子宫注射和输液两种方式使用青霉素来治疗奶牛子宫内膜炎[5]。经统计，我国部分地区奶牛场最常用β-内酰胺类包括氨苄西林、阿莫西林、青霉素、头孢噻呋等[6～13]。

2 β-内酰胺类药物作用机理

β-内酰胺类药物主要是在细胞繁殖期起杀菌作用[14]，其作用机制主要是干扰细菌细胞壁的合成。β-内酰胺类药物的结构与细胞壁的成分黏肽结构中的D-丙氨酰-D丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍黏肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。

3 β-内酰胺类药物残留带来的危害

过敏反应是β-内酰胺类药物带来的最常见危害之一，发生率最高可达5%～10%，主要表现为皮疹、血管性水肿，最严重者为过敏性休克，抢救不及时甚至会造成死亡。

除了引发毒性，β-内酰胺类药物的过度使用也是一个严重的公共卫生问题，已经引发了多种菌株的耐药性。Seligsohn等人使用加州实验法（CMT）、细菌培养法和MALDI-TOF质谱分析法对来自肯尼亚的798份牛奶样品进行了筛选，对分离出的菌株进行药敏试验发现均对多种β-内酰胺类药物耐药，只有部分金黄色葡萄球菌较敏感[15]。Yu等人从我国东北地区收集的奶样[16]，Ren等人从新疆南部收集的奶样[17]，Josef Bolte等人从德国北部收集的奶样[18]，Fikru Gizaw等人从埃塞俄比亚奥罗米亚中部五个地区屠宰场和奶牛场收集的奶样，进行药敏试验发现，分离出的菌株对青霉素等均具有显著耐药性[19]。

4 牛奶中β-内酰胺类药物残留检测方法

4.1 微生物检测法

β-内酰胺类药物残留检测方法有很多，微生物检测法是较为经典的方法。主要分为微生物抑制试验、氯化三苯四氮唑法和微生物受体检验法三种[20～22]。其基本原理主要是利用是否出现抑菌圈或者根据细菌与指示剂的颜色变化来判定是否存在β-内酰胺类药物残留。这种方法成本较低，但是灵敏度差，操作简单但是费时费力。

1944年，Foster和Wood Ruff创建管碟法，在此方法基础上，Mee Wes和Mlosevic发现使用藤黄八迭球菌来检测青霉素效果更好。1955年时，Neel和Calbert提出使用氯化三苯四氮唑法检测牛乳中青霉素含量[23]。在1989年，李青等人在使用氯化三苯四氮唑（TTC）试验来测定乳中有无青霉素残留时发现[24]，当样品所含青霉素浓度低于0.003IU/mL时，用TTC法进行检测结果均为阴性。除了方法本身的灵敏度，这可能跟制备菌液的用量和浓度等相关。孙晶玮等人在进行研究时发现[25]在制备菌液时，随着接种量的减少，青霉素得检出量也随之降低。而接种量过高，会容易引起假阴性结果发生。不仅如此，菌活力的大小也有可能影响检测结果的准确性[26]。

4.2 免疫分析法

免疫分析法[27]具有灵敏度高、特异性强、处理量大等优点，可以快速检测出牛奶中β-内酰胺类药物是否超标。其基本原理是抗原抗体的竞争性结合，常用方法为酶联免疫测定法（ELISA）、荧光免疫测定法(FIA)和放射免疫法。ELISA试剂盒检测与其他方法相比，由于用量小、前处理简单、检测时间短，而被牧场和企业广泛用于检测青霉素类药物残留。

但是免疫分析法影响因素较多，随着检测时间的变化极可能会出现假阳性或假阴性，仅能够用于半定量检测，与仪器分析法相比灵敏度略差。且试剂盒一次最多只能同时检测几种药物，不能够覆盖整类药物。

4.3 仪器分析法

仪器分析法借助了色谱的良好分离效能、高灵敏度和精确度，达到了定量检测的水平。目前能够定量且应用最广泛的还是与紫外(UV)、荧光、二级管阵列等检测器或质谱联用的液相色谱分析法。

4.3.1 液相色谱法

液相色谱分析以液体为流动相，色谱柱为固定相，由于化合物极性的不同在柱内被分离后，进入不同类型的检测器进行检测。由于其具有高灵敏度、高分离度，从而应用范围广，超过70%的有机化合物均适用于此法。

Noorfatimah Yahaya等人[28]合成了COU-2，并将其用作分散微固相中的吸附剂，用于高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）分析牛奶中的三种β-内酰胺类药物。该方法检测限为2.0～3.3ng/mL，回收率达到了80.3～99.5%。Victoria Samanidou等人[29]使用织物相吸附萃取（FPSE）作为提取介质代替了样品前处理中的蒸发溶剂和氮吹等耗时耗力的步骤，结合液相色谱二极管阵列检测对氨苄青霉素、氯沙西林、双氯西林、奥沙西林进行了分析，确定该方法定量限（苄青霉素除外）小于欧洲法规设定的最大残留限量（MRL）。

4.3.2 液相色谱-质谱联用法

随着科技的进步，仪器性能的提高也是日新月异，液质联用技术凭借更高的灵敏度和精确度已成为了检测食品安全最常用的方法之一。GB/T 21315-2007、GB/T 22975-2008和SN/T 2050-2008等均对牛奶中β-内酰胺类药物液质残留检测方法进行了规范。由于仪器、试剂耗材等型号、品牌的不同在流速和进样量的选择上略有不同[30～32]，各种方法回收率也各有差异。经过验证，多数方法回收率基本集中在60%～75%。回收率低的原因有很多，可能是固相萃取柱损耗、色谱柱分离效果不好、提取试剂选择不当等等。Louise[33]、Delia[34]、Luca[35]、王浩[36]、王承平[37]等人通过多种尝试，回收率有明显提高。

现在色谱-质谱联用已经是一项成熟的技术，但是由于牛奶基质中存在很多脂肪、蛋白质等杂质，需经过一系列的提取、分离、净化步骤才能进行检测。因此前处理工作较为复杂，且该设备体积较大、价格昂贵，在小型企业或牧场难以推行，仅适用于部门检验检测部门。

4.4 其他方法

除此之外还有一些新技术如表面等离子体共振（SPR）生物传感器和蛋白质芯片（Protein chip）技术，分别是应用了免疫学原理与根据生物分子特性建立的技术。

Miura等人于1981年就开始研究使用酶免疫传感器检测牛奶中的青霉素残留。随着电子信息科技的发展，生物传感器的研究也更加多样化。为了测定β-内酰氨类抗生素，Setford等人研究了一种受体结合蛋白电流亲合传感器，Gustavsson等人开发了基于一种羧基肽酶的微生物受体蛋白生物传感器技术[38]，Thavarungkul等人研制了一种非标记型的阻抗免疫生物传感器。多种结果均表明该法对β-内酰胺类药物具有很高的灵敏性[39]。蛋白质芯片技术是一种新兴的生物检测技术，金娜等人基于免疫竞争的原理，建立了呋喃唑酮代谢物的检测方法。事实证明，蛋白质芯片技术也可以用于进行兽药残留检测[40]。

但是这些依靠新兴技术开发的检测方法目前尚不成熟，还处于研究阶段，并不能被广泛使用。

5 总结

β-内酰胺类药物的使用范围广泛，耐药性严重，现在关于β-内酰胺类药物检测方法主要包括：微生物法、免疫分析法和仪器分析法三类。微生物法操作繁琐、肉眼观察误差大；免疫分析法不能定量，易出现假阳性或假阴性；仪器分析法由于试剂耗材、提取方法、净化过程、仪器型号等的不同，最终回收率也有很大差异。现代化仪器更新速度快、灵敏度更高，在现有条件的基础上，为简便操作流程、提高操作效率，有必要建立一种较为简便的前处理步骤，结合液质联用技术建立更加灵敏和准确的检测方法，为牧场常用的β-内酰胺类药物如氨苄西林、阿莫西林、双氯西林、苯唑西林、头孢氨苄等在牛奶中的残留检测提供新思路。