lncRNAs与乳腺癌免疫微环境及治疗研究进展

张 尊综述 孙圣荣审校

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤，也是全世界女性癌症相关死亡的主要原因[1]。尽管在免疫靶向治疗方面取得了重大进展，但是乳腺癌患者的整体预后仍然有待提高，并且尚且缺乏早期诊断，预警远处转移和药物耐药性的检测标志物[2]。一些研究表明，长非编码RNA(Long Noncoding RNAs，lncRNAs)可以影响免疫细胞的分化和功能以及肿瘤的进展[3]。本文综述了lncRNAs对乳腺癌免疫治疗反应的潜在预测价值。

1 lncRNAs概述

编码RNA(ncRNA)转录物，大多数在1 000到10 000个核苷酸之间。lncRNA的生物发生与mRNA有一些相似之处，由RNA聚合酶II转录，之后大部分转录物被剪接。但是，与mRNAs主要定位于细胞浆不同，大多数lncRNAs定位于细胞核中，部分以循环lncRNAs形式出现，lncRNAs在细胞核的表达水平较低，并且lncRNA表达模式具有细胞类型特异性。lncRNAs不编码肽或蛋白质，通过产生二级和三维结构，发挥双重RNA和蛋白质样作用，与多种分子相互作用，包括转录因子、成熟mRNA、染色质修饰复合物、RNA结合蛋白、DNA、新生RNA转录物、microRNA和染色质，主要在转录、翻译和翻译后水平调节下游靶基因的表达水平，从而广泛参与细胞功能的调节[4]。lncRNAs的功能发挥涉及各种机制，包括介导染色体间的相互作用、充当内源性RNA的海绵、调节mRNA代谢和表观遗传修饰等方式，通过改变靶点基因的表达而发挥相应的作用。因此，lncRNA表达水平的变化在各种疾病发生、发展过程均发挥重要的作用，包括乳腺癌[5]。

2 乳腺癌发生发展与免疫微环境

乳腺癌是女性最常见的癌症，也是全球第二大癌症死亡原因[6]。免疫靶向治疗改善了乳腺癌患者的预后，但仍有许多患者进展为转移性疾病且很难治愈，这可能是因为目前使用的大多数抗癌药物主要针对癌细胞。事实上， 乳腺癌不仅由肿瘤细胞组成，而且还由不同细胞类型组成的肿瘤微环境(Tumor Microenvironment， TME)，包括内皮细胞、几种基质细胞和免疫细胞。构成TME的细胞通过细胞间接触或细胞外基质复合物和形成微环境的可溶性因子与癌细胞进行复杂的相互作用。癌细胞与TME之间的持续动态相互作用可以促进或阻碍癌症进展。特别是肿瘤浸润性免疫细胞通过消除免疫原性肿瘤细胞来防止肿瘤进展，但与此同时，它们可以促进肿瘤对治疗的抵抗，形成肿瘤免疫原性，并选择能够逃避免疫反应的耐药肿瘤克隆。免疫疗法的引入改善了许多乳腺癌患者的预后，然而来自诊所的数据强调，免疫TME的组成对其有很大影响。在肿瘤的进化史中，肿瘤细胞与TME中的细胞之间建立了复杂而动态的通信，形成了一些肿瘤特征，如持续增殖信号、避免免疫破坏、诱导血管生成以及激活侵袭和转移。重要的是，不同类型的免疫细胞发挥着特定的作用，与癌细胞建立了强大的串扰网络。从这个意义上说，由先天性和适应性免疫细胞群共同构成所谓的乳腺癌免疫微环境(Breast Cancer Immune Microenvironment，BCIM)的肿瘤免疫编辑是肿瘤进展的重要决定因素。免疫编辑过程中涉及免疫抑制细胞和免疫刺激细胞。一些证据表明，这些细胞在BCIM中的存在对乳腺癌进展和治疗反应有显著影响。特别是，通过免疫刺激细胞(如一些巨噬细胞、淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、固有淋巴细胞(ILC)、树突状细胞(DC)和嗜酸性粒细胞浸润肿瘤对肿瘤控制至关重要[7]。然而，这些细胞产生的抗癌免疫反应被免疫抑制细胞的作用所抑制，例如骨髓源性抑制细胞(MDSC)、肥大细胞(MC)、调节性T细胞(Treg)和2型极化肿瘤相关巨噬细胞(M2样TAM)，这些细胞与发育中的TME有内在联系。了解BCIM中存在的主要免疫亚群，特别关注它们对乳腺癌患者预后的影响，以及它们对当前免疫疗法反应的影响，对于我们可能通过恢复免疫抑制以增强抗癌免疫反应的治疗策略很有帮助。

3 lncRNAs调控乳腺癌免疫微环境机制研究

3.1 lncRNAs在乳腺癌发生发展中的作用

在乳腺癌发生、发展中起到重要作用的lncRNAs主要有HOTAIR、ARNILA、MALAT1、HULC和AWPPH等。例如，HOTAIR(Hox Transcript Antisense Intergenic RNA，HOTAIR)是研究最为明确的lncRNA，它是一个剪接的、多聚腺苷酸化的转录本，包含6个外显子，长度约为2200个核苷酸，定位在染色体12q13.13[8]。HOTAIR表达水平上调时能促进多种肿瘤的发生和进展，包括胰腺癌，结直肠、肝细胞、胃、肺、卵巢和基底细胞癌，并且与患者预后差相关。HOTAIR诱导乳腺癌细胞迁移和侵袭，是第一个作为转移标志物的lncRNA[9]。在乳腺癌中，癌组织以及血液中的HOTAIR表达水平上调和乳腺癌的淋巴结转移有着密切的联系[10]。此外，HOTAIR上调的乳腺癌患者往往生存率较低。由于lncRNAs在体液中高度稳定，检测乳腺癌患者血液样本中的HOTAIR可以提供预后信息，并有助于监测治疗反应。上调的lncRNA ARNILA作为致癌lncRNA在乳腺癌局部区域浸润和转移中起着关键作用，它可以通过竞争性结合miR-204，释放SOX4，促进EMT和转移扩散。相反的，ARNILA的沉默有效地抑制了癌症的侵袭、迁移和转移[11]。

抑制肿瘤细胞增殖、侵袭迁移的lncRNAs主要有RMST、NEF和Airn。与癌旁组织相比，lncRNA RMST在乳腺癌组织中的表达水平非常低。RMST主要定位于细胞质，可以通过调控细胞质中的mRNA或蛋白发挥其生物学功能。RMST的过表达使TNBC细胞阻滞在G0/G1期，转染RMST的细胞迁移能力较低，表明RMST阻止了乳腺癌细胞的迁移和侵袭[12]。

3.2 lncRNAs调控乳腺癌免疫微环境免疫细胞

免疫细胞，如T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和髓样细胞等，受到lncRNAs相关途径的调节从而影响乳腺癌免疫的生物作用及机制。

3.2.1 CD8+T细胞：在突变衍生的肿瘤抗原中， MHC-I类复合物是以蛋白的形式存在于癌细胞膜上，并介导肿瘤细胞被细胞毒性CD8+T淋巴细胞识别、杀死。在抗原肽合成过程中， 抗原在细胞质蛋白酶体中被降解，这个降解的抗原随后被输送到细胞内质网中与MHC I类分子结合，经过内质网、高尔基体修饰后并被呈递到细胞表面。肿瘤中失调的抗原呈递机制可能促进癌细胞逃逸免疫监视。

据报道，三阴性乳腺癌癌组织中LINK-A(一种组织特异性lncRNA)的表达高于非TNBC组织。Hu等[13]证明，在基底样乳腺癌中，LINK-A的表达与APC和CD8+T细胞的丰度呈负相关，这表明LINK-A与免疫抑制之间存在正相关性。在转基因MMTV-Tg(LINK-A)小鼠模型中，LINK-A作为致癌lncRNA发挥作用，并启动转移性乳腺肿瘤，其表型与人类TNBC相似。此外，抗原肽负载复合物(PLC)对MHC I复合体的稳定和细胞呈现至关重要。通过抑制性GPCRs/PKA途径，LINK-A能促进多泛素化介导的降解PLC元件和肿瘤抑制因子(Rb和p53)的检测。在肿瘤治疗中，使用LINK-A或GPCR的锁定核酸(LNA)体内拮抗剂增加了MHC I类复合体和PLC组件的稳定性。

3.2.2 Trg细胞：Ni等[14]对40对乳腺癌患者标本和正常组织样本进行分析，发现在乳腺癌中，CD3+T细胞大多数是γδT1细胞；进一步发现CD73+γδT1细胞是乳腺癌中主要的调节性T细胞(Treg)群体，并且其在外周血中的发现率也与肿瘤负担有关。此外，CD73+γδT1细胞通过生成腺苷发挥免疫抑制作用。乳腺癌细胞以非接触方式调节γδT细胞上CD73的表达。微阵列分析和功能实验表明，乳腺癌细胞源性的lncRNA-SNHG16可以上调Vδ1 T细胞中CD73的表达。SNHG16作为ceRNA，通过吸附miR-16-5p，导致其靶基因SMAD5的表达降低，并导致TGF-β1/SMAD5通路增强，从而上调Vδ1 T细胞中CD73的表达。这项研究结果表明，乳腺癌衍生的外源性SNHG16/miR-16-5p/SMAD5调控轴增强了TGF-β1/SMAD5通路的激活，从而诱导Vδ1 T细胞中CD73的表达。这项研究确定了CD73+Vδ1 Tregs在BC中的意义，针对该亚群或阻断TDEs的治疗可能在将来用于乳腺癌的治疗。

3.2.3 浸润性T细胞：lncRNAs可能影响肿瘤浸润性T细胞的功能。Huang等[15]报道， NKILA是一种与NF-κB相互作用的长非编码RNA(lncRNA)，它通过抑制NF-κB活性来调节T细胞对活化诱导的细胞死亡(AICD)的敏感性，使得癌细胞逃避免疫攻击。在乳腺癌和肺癌微环境中，抗肿瘤CTL和TH1细胞比Tregs和TH2细胞对AICD更敏感。在抗原刺激的T细胞中，NKILA启动子区域组蛋白乙酰化明显增加，进而增强了由STAT1介导的NKILA转录。体外实验表明，Lnc-Tim3抑制小鼠体内CD8+T淋巴细胞产生IFN-γ和IL-2，并增强了抗凋亡基因的表达，如Bcl-2和MDM2。过表达Jurkat T细胞中的Lnc-Tim3上调了耗竭相关标志物，如PRDM1、LAG-3和PBX3。因此，Lnc-Tim3可以促进CD8+T淋巴细胞出现耗竭样表型。

3.2.4 巨噬细胞：巨噬细胞表现出高度的可塑性，这赋予了它们具有响应微环境信号的多种功能[16]。典型激活的巨噬细胞(M1)通常是由病原体相关分子模式(PAMP)刺激产生，而交替激活的巨噬细胞(M2)在IL-4、IL-13或IL-10刺激下产生。不同极化的巨噬细胞表现出不同受体、细胞因子和趋化因子的分泌以及效应因子的表达职能。M1巨噬细胞释放促炎症因子如IL-6和TNF-α有助于抗肿瘤免疫反应，而M2巨噬细胞通过上调IL-10和IL-2的表达而促进肿瘤的发展。目前已经开发了多种策略以靶向肿瘤微环境中的巨噬细胞，例如已证明通过重新极化M2巨噬细胞为抗肿瘤的M1巨噬细胞或增强抗原呈递能力可提高临床前模型的存活率[16]。 研究显示lncRNAs对巨噬细胞极化的影响，如linc00514通过增加转录因子STAT3的磷酸化，以转录方式促进Jagged1的表达。随后，Jagged1介导的Notch信号通路促进乳腺癌细胞分泌IL-4和IL-6，并最终诱导巨噬细胞M2极化[17]。GNAS-AS1/miR-433-3p/GATA3轴通过加速M2巨噬细胞极化促进ER+乳腺癌细胞的增殖和转移，该机制可能为ER+乳腺癌的治疗提供新的靶点和策略[18]。LincRNA-p21基因敲除促进了肿瘤微环境中巨噬细胞极化为促炎性M1巨噬细胞，这可能是由MDM2诱导蛋白酶体依赖性降解为p53并激活NF-κB和STAT3途径引起的。具有lincRNA-p21基因敲除的TAMs可诱导癌细胞凋亡，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。在体内，lincRNA-p21敲除巨噬细胞过继转移可抑制乳腺癌发展。该研究表明，lincRNA-p21是肿瘤环境中TAMs功能的关键调节因子，揭示了以单核细胞/巨噬细胞浸润为特征的肿瘤的新治疗靶点[19]。LINC00337通过M2型巨噬细胞加速乳腺癌细胞的恶性表型并诱导对紫杉醇的耐药性[20]。lncRNA SNHG1作为M2巨噬细胞极化的调节剂发挥作用，并调节肿瘤生长和血管生成。Zhong等发现SNHG1的敲除通过抑制STAT6磷酸化抑制M2巨噬细胞极化。SNHG1沉默显著减轻MCF-7细胞的迁移和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的管形成。此外， MCF-7细胞和巨噬细胞的细胞混合物的植入促进了肿瘤生长和血管生成，而巨噬细胞中SNHG1的敲除逆转了这种效应。这说明lncRNA SNHG1在巨噬细胞和乳腺癌细胞相互作用中的重要作用，可能为预防和治疗乳腺肿瘤转移提供了一种新方法[21]。研究发现lncRNA-Xist通过与miR-101竞争调节C/EBPα和KLF6的表达来介导巨噬细胞极化并影响乳腺癌增殖和迁移的机制。因此，促进M1巨噬细胞中Xist的表达和抑制M2巨噬细胞中miR-101的表达可能在抑制乳腺癌的增殖和迁移能力方面发挥重要作用[22]。

3.2.5 树突状细胞：树突状细胞在外周血单个核细胞中的分化和在肿瘤组织中的分布也可能受到lncRNAs的影响。SNHG1-lncRNA通过影响Treg的分化来介导肿瘤免疫逃逸。此外，SNHG1-lncRNA通过直接抑制miR-448的表达下调IDO的表达，并减小肿瘤体积，下调SNHG1、IL-10、IDO和Foxp3的表达水平[23]。

3.2.6 成纤维细胞：肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated Fibroblasts, CAF)是肿瘤微环境的重要组成部分。CAF和癌细胞之间的动态相互作用在肿瘤的发展和进展中起着至关重要的作用。Li等[24]人发现CAFs的外泌体lncRNA可以介导肿瘤细胞的代谢重编程。敲除CAF分泌的外显体中SNHG3基因，通过增加肿瘤细胞中的miR-330-5p和降低PKM表达来抑制糖酵解代谢和细胞增殖。SNHG3作为miR-330-5p海绵发挥作用，积极调节PKM表达，抑制线粒体氧化磷酸化，增加糖酵解羧化，增强乳腺肿瘤细胞增殖。

3.3 lncRNAs调控乳腺癌免疫微环境免疫细胞细胞因子

研究表明，肿瘤细胞可能上调非经典基因表达HLA分子，如HLA-G，可通过细胞因子如IL-10和IFN-γ逃避免疫监视。HLA-G与不同免疫细胞表面表达的抑制性受体结合，导致抑制性免疫反应，如抑制CD8+T的细胞毒性细胞和NK细胞。最近的研究报告说HOTAIR是一种ceRNA，可通过竞争性结合miR-152或miR-148a来调节HLA-G的表达在癌细胞中[25]。HOTAIR在不同的人类恶性肿瘤组织中过度表达，且与癌症有关进展和转移。在T细胞中，吲哚胺对色氨酸的还原作用和2,3-双加氧酶1(IDO1)可激活应激反应激酶GCN2，抑制T细胞增殖并诱导将幼稚的CD4+T细胞分化为Treg。因此肿瘤中IDO1的表达可能有助于免疫逃避。肿瘤细胞表达的PD-L1与T细胞表达的PD-1相互作用，可促进特异性T细胞的凋亡和细胞因子抑制信号的生产。据报道，lncRNAs通过多种机制介导PD-L1作用于肿瘤细胞。研究表明，通过调节PD-L1的表达与蛋白质相互作用，lncRNA-MALAT1是肿瘤进展过程中的一个关键调节器，尤其是在肿瘤免疫逃避过程中[26]。

一些研究表明肿瘤细胞来源的lncRNAs可能还参与CCL2、凝血因子X(FX)和外源性miRNA等因子的分泌，通过影响巨噬细胞的募集、增殖和分化促进肿瘤转移。Lnc BM是一种转移相关的lncRNA，可能通过促进脑TME中巨噬细胞和乳腺癌细胞之间的通讯，进而加速乳腺癌脑转移患者的肿瘤进展。肿瘤细胞来源的Lnc BM促进STAT3依赖性的CCL2和ICAM1表达，并分别介导了脑内巨噬细胞的募集和血管的选择。被招募的巨噬细胞分泌IL-6和抑瘤素M，激活乳腺癌细胞中的Lnc BM/JAK2/STAT3通路[27]。有研究表明，lncRNA X-非活性特异性转录本(X-inactive-specifific Transcript，XIST)可以作为脑转移性乳腺癌中的肿瘤抑制因子[28]。在乳腺癌患者的脑转移瘤中，XIST显著下调。敲除小鼠乳腺中的XIST基因刺激了原发肿瘤的生长和脑转移。XIST的缺失也增强了外体miRNA-503的分泌，并促进了小胶质细胞的M2极化，上调了小胶质细胞中的免疫抑制细胞因子，进而抑制T细胞的增殖。肿瘤来源的lncRNAs已被证实可以作为在TME中肿瘤细胞和巨噬细胞之间协调通信的信号传递媒介[29]。

在TME中，lncRNAs在肿瘤细胞中受到一些可溶性免疫抑制细胞因子的调节，因此其表达可能受到抑制，从而促进了肿瘤的免疫逃逸。这种调节模式表明基质细胞和癌细胞之间存在交联。在乳腺癌细胞中，由CAFs分泌的TGF-β可增加癌易感候选基因9(CASC9)lncRNA的表达，其通过应答miR-215上调TWIST2来促进体外和体内的肿瘤细胞迁移[30]。此外，生物信息学分析预测了miR-215和CASC9之间存在互补序列。TME中的促炎细胞因子IL-6可能促进乳腺癌的进展。IL-6可以激活Arid5a(AT-rich Interactive Domain 5a，Arid5a)表达，促进lncRNA AU021063的转录。接下来，AU021063通过稳定Tribbles同源物3(Trib3)和激活Mek/Erk信号通路促进了乳腺癌转移。将Arid5a、AU021063或Trib3敲除可减少乳腺癌在体外和体内的转移[31]。

4 lncRNAs在乳腺癌临床免疫治疗中的应用

尽管一些研究已经证明了lncRNAs在肿瘤进展和免疫反应调节中的作用，但lncRNAs在肿瘤临床免疫治疗中的应用有限。一项关于lncRNA作为乳腺癌的生物标志物的临床研究：研究者前期已成功识别并独立验证了一个与乳腺癌预后相关的RNA特征，该RNA特征可用于区分乳腺癌患者复发风险的高与低；该研究旨在验证前期识别的mRNA-lncRNA标志物的有效性，并进一步探索能否对由RNA特征预测出的高危三阴性乳腺癌(TNBC)患者进行更精准的化疗，即向高风险患者予以多西他赛、阿霉素、环磷酰胺、吉西他滨联合顺铂方案，向低风险患者予以多西他赛、阿霉素联合环磷酰胺方案(NCT02641847)。目前该项研究正在进行中。

lncRNAs参与了肿瘤免疫治疗中的关键分子表达和通路的调控，也能够预测接受肿瘤免疫治疗患者的预后。临床肿瘤免疫治疗包括肿瘤疫苗、基于T细胞的免疫治疗和免疫检查点阻断(Immune Checkpoint Blocking，ICB)等。ICB治疗的有效性在本质上取决于MHCs显示的T细胞识别的肿瘤细胞新抗原，肿瘤新抗原识别的缺乏会使肿瘤对PD-L1/PD-1通路阻断治疗不敏感。因此，基于新抗原的癌症疫苗，包括新抗原疫苗、肽疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗和DC疫苗均是为了克服这些局限性而开发的癌症免疫治疗，其中部分疫苗已经进入临床试验研究[32]。在PD-L1+的TNBC患者中，乳腺癌ICB治疗的总有效率在10%到18.5%之间。HLA-A2+的转移性TNBC患者使用PVX-410癌症疫苗和彭布罗利珠单抗联合治疗(NCT03362060)正在进行Ib期临床试验。此外，lncRNAs参与抗原的调节临床表现可能作为治疗的靶点肿瘤疫苗。LINK-A是一种组织特异性lncRNA[13]。研究发现，LINK-A在乳腺癌小鼠模型的乳腺肿瘤中被诱导表达。抑制LINK-A的表达可以抑制肿瘤的进展。此外，LINK-A锁定核酸(Locked Nucleic acids，LNAs)和ICB的联合治疗可协同抑制肿瘤生长并且显著延长荷瘤小鼠的存活时间。恢复肿瘤抗原呈现途径的治疗策略可能提高缺乏肿瘤抗原性的乳腺癌对ICB治疗的敏感性。因此，LINK-A作为预测接受ICB治疗的乳腺癌患者预后的有效生物标志物具有巨大潜力。LINK-A也可能作为一个潜在的治疗靶点，使乳腺癌对免疫检查点抑制剂敏感。

过继性T细胞疗法，尤指嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤的临床治疗中取得了显著疗效。美国食品和药物管理局(FDA)已经批准Yescarta和Kymriah两种CAR-T细胞产品用于治疗血液系统恶性肿瘤。然而，CAR-T细胞治疗实体恶性肿瘤的疗效有限，这可能是由于缺乏足够CAR-T细胞运输到肿瘤部位、T细胞激活不足、从体内别处转移的T细胞或肿瘤中增强的免疫抑制肿瘤微环境。为了克服这些限制，需要探索提高移植T细胞存活率的创新途径。最近的一篇综述总结了提高T细胞抗凋亡能力的策略，如在CAR基因中使用共刺激结构域，抑制特定的死亡受体途径，以及插入抗凋亡分子(BCL-XL或BCL-2)的基因[33]。对于T细胞凋亡的表观遗传调控，lncRNAs可能作为CAR-T细胞治疗的辅助靶点。据报道，NKILA能够增强T细胞介导的细胞凋亡。Huang等[15]用shRNA敲降CD8+T细胞的NKILA后，乳腺癌异种移植小鼠模型肿瘤的生长被显著抑制。与未敲降组相比，敲降组中NF-κB活性、抗肿瘤T细胞(CTL、TH1)的毒性和抗凋亡基因的表达增强。该研究提示了乳腺癌中CAR-T疗效不佳的原因。靶向NKILA后再将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和CAR-T细胞转入，沉默的NKILA通过抑制T细胞活化诱导的细胞死亡(AICDs)来克服肿瘤免疫逃避，将提高CAT-T治疗癌症的疗效[16]。

5 结论和展望

lncRNAs对基因调控的转录后调节是各种病理生理过程中的关键因素。lncRNAs在免疫抑制性TME调节中的关键作用提示lncRNAs可作为乳腺癌诊断的生物标志物和预后评估。此外，lncRNAs是潜在的乳腺癌的治疗靶点。当然，需要进一步的研究包括建立lncRNA特异性动物模型等从而更好了解lncRNA在TME中的作用，以便临床应用。

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