神经新生角度探讨肿瘤增殖与转移

宋梦瑶，宋 莉，周银银，贾 琦，李晓曼，2，陆 茵，2，3

(南京中医药大学 1.药学院，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室、2.江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心、3.江苏省中医药与再生医学研究国际合作联合实验室 江苏 南京 210023)

越来越多的证据表明，正如健康组织需要神经调节、支配身体稳态一样，肿瘤也需要神经程序来促进其生长和发展[1]。肿瘤自身增殖与转移依赖于神经新生早已得到临床证实。类似于肿瘤血管新生，肿瘤细胞释放神经营养因子，通过肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)直接或间接地作用于肿瘤周围的外周神经末梢，诱导轴突新生，促进神经生长。

肿瘤内神经新生过程产生了复杂的生物学结构改变。在神经发育和再生过程中，神经生长受神经支配靶器官释放的神经营养因子调控。神经末梢突触释放的神经递质和其他营养因子可以激活肿瘤细胞上相应的神经递质受体，加速肿瘤组织内神经轴突的新生。反之，肿瘤细胞最终在神经周围生长或侵入神经，这一过程称为神经周围侵袭或神经浸润(peripheral nerve invasion，PNI)。神经生长不断向外扩散各类神经递质，一方面激活了肿瘤的生长与转移，另一方面促进了神经浸润肿瘤。神经的大量新生刺激了肿瘤的增殖与转移，而神经最终也会被肿瘤细胞包围、侵入。神经-肿瘤细胞的这种相互干扰最终达到神经新生与肿瘤发生发展二者相互促进的终效应。近几年，基因工程与影像学的最新进展使人们对肿瘤神经调节的分子基础与机制有了更加深入的了解。在临床研究证据的推动下，以靶向神经和TME之间的相互作用治疗癌症为目标，新的转化治疗技术与方法正在开发。本文对神经新生在调控肿瘤增殖与转移中的作用以及针对于神经新生在检测技术与治疗方法上所面临的困难与策略进行综述。

1 肿瘤神经新生改变肿瘤微环境

TME是一个包含有肿瘤细胞、间质细胞、免疫细胞、血管内皮细胞等各种物质的微生态环境。神经细胞在其中也发挥了重要的作用，因此，神经系统与TME之间的相互作用极大程度上影响了神经新生与肿瘤的增殖、转移。神经-肿瘤微环境诱发的神经新生，为肿瘤细胞提供了良好的生长环境。

1.1 神经生长因子驱动神经新生加速肿瘤发展目前研究发现，受神经支配的靶器官释放的神经营养因子包括神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神经营养蛋白3(neurotrophic protein 3，NT3)和神经营养蛋白4/5(neurotrophic protein 4/5，NT4/5)等。以上神经营养因子均已被证明可通过刺激神经末梢中的酪氨酸激酶受体驱动神经新生[2]。其中NGF是最早被发现在神经新生中发挥着主要驱动作用的重要神经营养因子。前期研究表明，NGF在前列腺癌、胃癌、胰腺癌[3-4]等癌症的神经支配过程中发挥重要作用。除此之外，粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、神经生长因子前体(nerve growth factor precursor，proNGF)对前列腺癌也表现出类似的驱动作用[5]。

NGF作为神经营养因子内最重要的组成部分，与肿瘤内神经新生有密切关系。三分之一的浸润性导管乳腺癌内会检测到神经，神经密度与肿瘤的侵袭性以及肿瘤细胞释放的NGF有关[6]。Ayala等[7]发现前列腺肿瘤部位释放的NGF会驱动神经轴突新生，高组织病理学分级的前列腺癌区域比低等级或良性前列腺增生的区域存在更多的神经。同时，前列腺癌细胞proNGF的产量增加与TME中的神经密度成正比，表明proNGF/NGF是前列腺癌肿瘤神经新生的分子介质。Rowe等[8]通过组织学检测发现，与正常的甲状腺组织相比，proNGF在甲状腺肿瘤组织内有所增加，并且病理评分显示其在淋巴结转移中的染色强度明显高于相应的原发性肿瘤。但是，proNGF在血清中的高表达却与甲状腺癌的发生与否无关[9]。

NGF还是疼痛的诱导因素。肿瘤对神经造成的压迫导致了癌症患者的痛苦，多项研究表明在肿瘤治疗中靶向NGF是一种有效减缓患者疼痛的手段[10]。鉴于NGF在肿瘤神经支配中的作用，未来神经营养因子完全可以用作癌症诊断和预后的生物标志物。

1.2 神经新生诱导肿瘤血管生成血管新生是肿瘤转移的关键环节，轴突引导生长分子如神经肽和信号素可以调控血管生成。在肿瘤血管生成的治疗过程中，已发现部分轴突引导分子能够通过有效抑制肿瘤血管生成途径抑制肿瘤增殖与转移。Plexin-A4作为一种神经纤毛蛋白传递配体，通过与FGFR1和VEGFR-2酪氨酸激酶受体形成稳定的复合物，增强内皮细胞中VEGF诱导的VEGFR-2磷酸化以及bFGF诱导的细胞增殖[11]。来源于神经系统信号素能够通过调节VEGF促进肿瘤相关的血管生成。Sema3B是一种分泌型信号素，研究表明Sema3B的过表达可以抑制肺癌、乳腺癌细胞的增殖。除了对肿瘤细胞的抑制作用外，Sema3B还可以通过Nrp1排斥内皮细胞，因此被认为可以作为血管生成抑制剂[12]，而Sema3E诱导Arf6激活可以诱导快速粘着斑分解和内皮细胞塌陷，进而抑制血管生成[13]。

1.3 神经新生触发肿瘤免疫微环境改变三叶因子2(trefoil factor 2，TFF2)是一种脾脏产生的分泌肽，可与ChAT-EGFP共定位，标记CD4+T细胞。TFF2受到炎症反射的调节，在急性状态下，炎症反射导致记忆性CD4+T细胞释放乙酰胆碱，抑制巨噬细胞产生TNF-α，最终阻止了髓源性抑制细胞的增殖与发展[14]。内源性大麻素，被称为是中枢神经系统内的神经调节剂，控制着免疫细胞的分泌特性。可以直接靶向白细胞，并通过抑制P物质(substancep，SP)和降钙素基因相关肽(calcitonin-gene related peptide，CGRP)发挥其神经学作用[15]。在受损神经中，巨噬细胞衍生的IL-1β诱导非神经元细胞中NGF的合成。炎症过程会诱导白细胞的积累和疼痛相关介质的释放，促进神经元可塑性和外周神经支配[16]。当巨噬细胞、肥大细胞和其他白细胞释放NGF时，可以促进肿瘤神经支配的轴突转换，通过招募脑源性神经前体促进癌症进展。M2型巨噬细胞在功能上被募集并有助于神经修复，而M1型巨噬细胞的功能是破坏受伤的神经[17]。巨噬细胞可以通过分泌VEGF再生受损的神经，而施万细胞使用VEGF来迁移和引导神经生长。此外，mTOR-Sema6D-PPARγ轴在巨噬细胞极化中起关键作用。mTOR的抑制或Sema6D的缺失阻断了抗炎巨噬细胞极化，伴随着PPARγ表达、脂肪酸摄取和脂质代谢重编程的严重受损[18]。

1.4 其他交感神经与副交感神经元释放能激活感觉神经元的分子，而感觉神经元的切除可显著减缓瘤变损伤的发展[4]。Chen等[19]发现，应激诱导的神经内分泌激活会极大提高乳腺癌的远端转移率。转移过程中，β-肾上腺素能信号参与了CD11b+F4/80+巨噬细胞向原发性乳腺癌部位的浸润，进而发出促转移基因的表达信号。

研究发现，背根神经节和胰腺癌细胞之间存在旁分泌NGF信号[20]。此外，其他肿瘤细胞的体外实验同样证实了肿瘤细胞产生外泌体可以诱导肿瘤神经支配[21]，这一发现为肿瘤的神经发生提供了不一样的研究途径，增加了神经元分泌的外泌体可能作为具有临床重要性和实用性的新型癌症生物标志物的可能。高级胶质瘤分泌的NLGN3在脑TME中发挥调节肿瘤生长的作用。国际癌症基因组联合会对甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌进行分析发现多种癌症类型均发生NLGN3突变和拷贝数变异。此外，GRP78和BDNF同样被鉴定为可促进胶质瘤的增殖[22]。SLIT/ROBO信号传统上被描述为轴突引导的胚胎调节器基因。Bapat等[20]通过外显子组测序及拷贝数分析确定出该信号是导致胰腺组织癌变的突变基因，并存在频繁和多样的体细胞异常。这一发现为轴突导向基因参与胰腺癌的发生提供了有力的支持性证据。

综上所述，神经新生已成为判断肿瘤发展的潜在标志，同时肿瘤细胞释放的NGF似乎是TME中神经浸润的主要驱动力。

2 肿瘤神经新生的标志物探讨

目前，肿瘤微环境内轴突新生与神经新生介导肿瘤的发生发展检测的方法学尚未有成熟的技术报道。受诸多因素阻碍，临床前研究涉及到肿瘤的病理学与神经相关标志物检测两个方面。在临床角度，常规肿瘤的组织结构中很难观察到神经，通常只有大神经在病理检查中可见。然而，TME中所存在的多数神经都是小神经纤维，这对于肿瘤神经浸润的病理及实验结果的分析带来了一定的困难。

采用蛋白质组学与免疫组学相结合对肿瘤的生物标志物进行探索是目前肿瘤神经检测的主要方式。研究多采用免疫组化方法检测特定神经元生物标记物，如泛神经标记物PGP9.5就是一种广泛用于所有神经类型的组化标记物。此外，还有许多特定类型的神经元生物标记物，如外周神经元表达Ⅲ型中间丝蛋白，以及微管蛋白β-3。囊泡乙酰胆碱转运蛋白可区分出胆碱能神经；酪氨酸羟化酶可有效区分肾上腺素能神经[3]；Brundl等[23]使用神经胶质原纤维酸性蛋白或S100进行免疫染色，在TME中鉴定出外周神经胶质细胞；Dobrenis等在实验中运用抗微管结构蛋白(microtubule associated protein 2，MAP2)和抗磷酸化神经丝-H(phosphorylated neurofilament-H，pNF-H)对神经元细胞进行染色评估神经突起情况[2]。此外，OLMF4多肽在神经系统的早期发育和功能组织中发挥作用，已被确定为在结直肠癌中上调的癌症生物标志物[6]。蛋白质组学分析显示OLMF4在胃癌、胰腺癌、头颈癌和前列腺癌中也存在类似上调，同时在乳腺癌检测中，它的表达还与肿瘤的病理分级呈现正相关[24]。LIF可作为胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDA)的有效生物标志物，Bressy等[25]还发现对LIF诱导的PDA进行信号靶向治疗可以限制PDA相关神经重构。此外，研究中还常将病理标本进行组织微阵列检测和GS评分，并将结果与免疫组化或免疫荧光中的标记物检测相结合来对样本进行更加精确、特异性的分析。

3 针对神经轴突新生的治疗策略

肿瘤轴突发生与癌症诊断、预后和治疗等潜在临床应用有关。靶向神经营养生长因子、去神经支配、抑制外泌体分泌均是针对神经轴突新生的治疗策略。临床前研究可以采用动物模型研究这些治疗策略，但是目前在临床中具体实施尚存在一定的难度与挑战性。

3.1 靶向神经营养因子通过靶向与肿瘤轴突新生有关的神经营养因子来抑制肿瘤支配是一种较为合适的治疗策略。NGF具有神经营养作用，可以驱动肿瘤轴突新生，因此靶向NGF可以防止TME中神经的生长[26]。虽然NGF对于轴突新生必不可少，但在成年个体中一旦组织的神经支配被建立，NGF便失去活性，不再参与神经元的维持。有趣的是，它依然可以通过原肌球蛋白受体激酶(tropomyosin receptor kinase，TrkA)来介导疼痛[27]。因此肿瘤发展的早期阶段靶向NGF具有同时解决肿瘤发生发展及肿瘤压迫所引起的疼痛的独特潜力。

3.2 去神经支配动物模型中应用去神经支配治疗已经取得成功，但真正在临床中实施还存在较大的争议与挑战。首先手术难度大；其次准确发现在肿瘤中起主要作用的神经纤维或调控部位是目前临床前及临床研究所未能解决的问题。基于此衍生出了一种治疗方案：将神经毒性药物注射到肿瘤，靶向抑制神经元。肉毒杆菌毒素作为一种胆碱能信号转导的抑制剂，可以通过模拟自主神经广泛用于肌肉痉挛等临床问题。目前肉毒杆菌毒素对肿瘤去神经支配的作用已经在动物模型中进行测试，基于肉毒杆菌毒素的前列腺神经支配的第一阶段临床试验结果已经可用[28]。这从侧面反映出胆碱能信号确实参与肿瘤生长，并且去神经支配这一途径可用于辅助癌症的治疗及预后。未来临床中，肿瘤的去神经化治疗将会逐渐走入人们视野。

3.3 肾上腺素受体阻滞剂近几年肾上腺素受体阻滞剂在肿瘤领域崭露头角，例如，普萘洛尔(β-肾上腺素受体阻滞剂)对前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌等癌症的增殖、转移均展现出治疗效果。对于慢性应激通过促进去甲肾上腺素(α-肾上腺素受体激动剂)释放加速肿瘤增殖与转移已有不少研究[29]。这提供了一种可能——阻断肾上腺素释放途径可能会通过控制神经支配以抑制肿瘤细胞中肾上腺素受体的表达，进而阻止交感神经释放去甲肾上腺素，起到抑制肿瘤发展的作用。然而，这其中真正发挥作用的机制目前还没有明确阐述。这一治疗方法未来应用于临床可能为患者带来普适性的治疗效果。

最近一项研究显示，在前列腺癌小鼠模型中，来自中枢神经系统脑室下区的神经干细胞随着血液迁移到前列腺肿瘤部位。神经祖细胞表达了双皮质醇(double cortisol，DCX)渗透到前列腺肿瘤中启动了神经发生，并能产生新的肾上腺素能神经元[30]。这一现象揭示了中枢神经系统和前列腺肿瘤之间一种独特的相互干扰模式，提示了肿瘤治疗可能的一种新的神经靶向方案。

4 总结与展望

神经是肿瘤发生发展研究中的新型调节器。通过TME内各类神经营养因子与神经递质的分泌，神经新生与肿瘤发生发展之间相互作用、相互促进。临床研究也针对神经新生采取了靶向NGF、去神经支配等治疗策略。在过去几年，已经有大量开创性的科学研究分别从不同方面证实了神经在肿瘤发生发展过程中存在着的驱动作用。

肿瘤神经新生的检测与癌症诊断、临床应用及预后均存在重要联系。大量研究表明，神经密度在原发性肿瘤中增加，并且与转移性或侵袭性疾病有关。量化神经密度有助于区分肿瘤的进展情况。此外，检测和量化驱动肿瘤轴突新生的神经营养因子也具有极大的诊断和预后价值。目前，临床仍有大量的癌症诊断需要对神经浸润程度进行检测以确定癌症的发展阶段。因此，急需开发更加便捷、敏锐的检测手段与方法应用于临床。肿瘤神经生物学这一新兴的领域会有更多的科研学者及临床专家们给予关注。与此同时也为肿瘤的诊断、治疗、预后带来了新的突破与挑战。