星形胶质细胞U251稳转FOXO1基因细胞系构建及其蛋白互作生物素验证

曾 挺，郭媛媛，郭婕妤，刘 超，刘 武

(湖北科技学院医学部 1.药学院、2.糖尿病与心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100)

蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions，PPIs)是细胞生命活动的基础，以BioID和APEX为代表的蛋白质邻近标记技术逐渐被应用于蛋白质相互作用研究[1, 2]。由于蛋白的相互作用大多是依靠氢键、盐键和疏水相互作用力进行，它们的空间距离都非常的短，所以通常认为互作的蛋白必定相互邻近[3]。TurboID是一种比BioID或APEX具有更高催化效率的蛋白质(标记时间从18 h缩短至10 min)，由于很多蛋白发挥的结合与催化作用是很短暂的，理论上利用这个技术可以找到一些比较新颖的结合蛋白[4]。大量研究表明，FOXO1调控许多靶点，如参与细胞凋亡和自噬的基因、抗氧化酶、细胞周期阻滞基因以及代谢和免疫调节因子[5-6]，被认为是一种具有复杂活性的超级转录因子。因此，我们将利用TurboID的高效性来寻找FOXO1的互作蛋白。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂人胚肾上皮细胞株293T及星形胶质细胞株U251，均保存于实验室。脂质体核酸转染试剂、胰酶、嘌呤霉素和慢病毒浓缩试剂盒，均购自上海翊圣生物科技有限公司;银染试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；相关抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；全基因合成、引物及测序服务均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 FOXO1-TurboID过表达质粒的构建TurboID-flag基因序列经全基因合成并替换EGFP连接上plenti-cmv-EGFP质粒，即为plenti-cmv-TurboID，以人的cDNA为模板扩增FOXO1基因(引物FOXO1-F：ATAGAAGACACCGACTCTAG AATGGCCGAGGCGCCTCAG；FOXO1-R：GGGGTATACGTATACGGATCCGCCTGACACCCAGCTATGTGTC)，将其片段重组上线性化的plenti-cmv-TurboID质粒。经转化，涂板，筛选阳性克隆，提取质粒经酶切鉴定后送公司测序，测序正确的质粒命名为FOXO1-TurboID。

1.3 FOXO1-TurboID和plenti-cmv-EGFP质粒的慢病毒包装将质粒FOXO1-TurboID和plenti-cmv-EGFP分别与慢病毒包装质粒利用293T细胞进行慢病毒包装，再使用慢病毒浓缩试剂将细胞培养基进行处理得到病毒浓缩液。

1.4 构建FOXO1过表达细胞系及其验证将携带有FOXO1-TurboID和plenti-cmv-EGFP质粒的病毒浓缩液对U251细胞进行感染处理，通过观察感染plenti-cmv-EGFP质粒细胞的荧光强度和嘌呤霉素的抗性筛选，以及western-bolt蛋白电泳判断细胞系是否稳转成功。携带有plenti-cmv-EGFP质粒的细胞命名为EGFP-U251，携带有FOXO1-TurboID质粒的细胞命名为FOXO1-U251。

1.5 基于TurboID的邻近生物素标记技术参照Branon等报道的方法[4]分3组进行12 h生物素标记实验，分别为EGFP-U251细胞、FOXO1-U251细胞以及使用饱和脂肪酸(棕榈酸，PA)模拟高脂环境处理12 h的FOXO1-U251细胞。

1.6 生物素标记蛋白亲和纯化以及银染色法鉴定收集1.5中的3组实验细胞，利用Beads磁珠进行蛋白的亲和纯化，再将纯化后的磁珠进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，银染色法观察EGFP-U251细胞、FOXO1-U251细胞以及经过PA处理后的FOXO1-U251细胞，通过蛋白条带的差异判断是否寻找到大量互作蛋白。

2 结果

2.1 FOXO1-TurboID过表达质粒的构建FOXO1-TurboID过表达质粒的组成包含目的基因FOXO1、生物素标记酶TurboID、核定位信号NLS和标签蛋白Flag，以及两个不同的抗性筛选标签。已经过公司测序，序列正确。

2.2 FOXO1-TurboID过表达稳转细胞系的构建与验证经嘌呤霉素筛选后观察EGFP-U251细胞系，荧光显微镜下有明显的绿色荧光，可知EGFP-U251稳转细胞系构建成功。之后对经过嘌呤霉素筛选后的细胞系进行Western blot蛋白电泳验证，确定FOXO1-TurboID过表达稳转细胞系的构建成功。

2.3 生物素标记及银染色法鉴定将“1.5”中3组细胞经过12 h生物素标记实验后，利用磁珠拉取标记有生物素的蛋白，再进行银染色法鉴定，观察到FOXO1稳转细胞系与对照组EGFP-U251细胞系蛋白条带之间的巨大差异，证明已经拉到大量与目的基因FOXO1互作的蛋白，FOXO1-U251细胞与经过PA处理后的FOXO1-U251细胞之间的表达差异有待于进一步的质谱分析。

3 讨论

目前已知受FOXO调节的基因主要包括调控细胞周期、细胞死亡、细胞自噬、细胞代谢、细胞抗氧化等相关基因，FOXO某种程度上可以看做调节一大类功能基因的“开关”，是医药生物以及生命科学领域重要的研究对象[7]。

在本研究中，我们构建重组FOXO1-TurboID过表达质粒，利用慢病毒包装技术得到了可持续表达FOXO1-TurboID基因的细胞系。之后再对稳转EGFP-U251和FOXO1-TurboID的U251细胞进行了生物素标记实验，并对其中的一组稳定过表达FOXO1-TurboID的U251细胞进行棕榈酸(PA)处理。经过生物素亲和纯化和银染色法，EGFP-U251作为假阳性对照组可反映内源性生物素与磁珠的互作，拉取少量蛋白；而FOXO1-U251细胞与经过PA处理后的FOXO1-U251细胞这两组均可以拉取大量互作蛋白，这两组之间所拉取的蛋白也存在一定差异，这种差异可以反应PA处理条件下FOXO1实时拉取互作蛋白的变化，所拉取的蛋白有待于进一步的蛋白质谱鉴定。该技术的成功应用证明了TurboID邻近标记技术的实用性和高效性，在FOXO1稳转细胞系中的成功标记对明确该基因的功能及其参与的调控网络奠定了基础，对日后其他基因的研究也提供了一定的思路。