HCV感染者直接抗病毒药物治疗对miR-181a调节CD4+T淋巴细胞衰老相关指标的影响

李瑞娟，权会琴，王晓艳，边培育，叶传涛，范 超，张 颖，周 云

(空军军医大学唐都医院传染科，陕西 西安 710038)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)会引起慢性丙型肝炎，进而发展成肝硬化，甚至演变成肝细胞癌。HCV感染后，早期活跃并持续的CD4+T细胞增殖反应能对抗很多HCV蛋白，预测疾病转归[1]。研究发现很多miRNA能调节HCV的复制与疾病发展和预后。miRNA可直接作用于HCV RNA，或通过HCV相关的宿主信号通路来调节HCV复制及疾病进展[2]。本研究小组此前发现HCV能下调miR-181a表达，引起双重特异性磷酸酶6过表达，损害CD4+T细胞功能，导致细胞衰老[3]，还发现HCV感染相关的CD4+T细胞衰老可由ΔNp63-miR-181a-SIRT1信号通路对抗调节[4]。沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin1， SIRT1)在HCV感染者CD4+T淋巴细胞上表达增高，但是miR-181a、SIRT1在HCV感染者服用直接抗病毒药物(direct antiviral agents，DAA)治愈后CD4+T淋巴细胞上的表达情况尚无研究。本研究拟检测并比较HCV感染者经DAA治疗前后miR-181a对CD4+T淋巴细胞衰老、负性调节因子相关指标的影响，并探讨其临床意义。

1 对象与方法

1.1 对象

收集在空军军医大学唐都医院传染科就诊的HCV感染者及治愈者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，诊断标准依据世界卫生组织发布的《2016年欧洲肝病学会丙型肝炎治疗指南》[5]。实验分为HCV感染未治疗组(HCV组，26例)、HCV治愈组(22例)、健康对照组(20例)，入组标准及治疗方案同本实验室之前设计方案[6]。具体HCV组入组标准为HCV RNA和抗-HCV阳性6个月以上，年龄大于18岁，排除其他噬肝病毒患者、肝癌患者及自身免疫性肝病患者；HCV治愈组入组标准为慢性丙型肝炎患者完成12周抗病毒治疗，达到病毒学应答，HCV RNA均低于检测下限，肝功能指标ALT、AST正常，治疗采用索磷布韦联合达卡他韦方案。本研究经空军军医大学唐都医院医学伦理委员会批准(许可证号：TDLL-2016142)，并与患者及健康对照者签署知情同意书。

主要试剂：用于磁珠分选细胞的CD4+T淋巴细胞分离试剂盒购自德国美天旎公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自德国Qiagen公司；miR-181a引物、P53、P21引物购自上海生工公司；hsa-miR-181a-5p和SIRT1基因双荧光素酶检测由上海生工公司提供；流式抗体CD3、CD4、CD57、SIRT1等购自美国BD公司；RPMI1640、OPT-MEM Ⅰ 培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 使用CD4+T淋巴细胞分离试剂盒将CD4+T淋巴细胞从PBMC中分离，用TRIzol提取RNA，逆转录成cDNA，通过qRT-PCR检测各组miR-181a，SIRT1、P53、P21mRNA的表达水平。其中miR-181a以U6为内参基因，SIRT1以GAPDH为内参基因，P53、P21以β-actin为内参基因，引物设计如表1。qRT-PCR反应条件：95 ℃ 5 min；进入循环95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，共循环42次；60 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 30 s。生成扩增曲线及熔解曲线，得出Ct值，采用2-ΔΔCt算法计算各目的基因表达量与内参基因进行标准化，得到各基因的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 双荧光素酶报告基因检测 准备好用于转染的293T细胞和目的质粒，将10 μL DMEM与0.16 μg的h-SIRT1质粒以及5 pmol的 hsa-miR-181a/Negative Control充分混匀后室温放置(溶液A)，将10 μL DMEM与0.3 μL的转染试剂(浓度为0.8 g/L)充分混匀(溶液B)，将溶液A与B充分混匀，室温放置20 min。将转染混合物加入细胞并混匀，37 ℃，50 mL/L CO2条件下培养，转染6 h后换新鲜培养基，转染48 h后收集细胞，用Promega Dual-Luciferase系统检测。以96孔板每孔100 μL的量加入裂解液，室温摇床上缓慢摇15 min，将细胞裂解液吸至1.5 mL离心管，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清移入新管；96孔板中加入Luciferase Assay Reagent Ⅱ 工作液100 μL；加入20 μL细胞裂解液，测定记录Firefly luciferase值，此值为内参值。加入100 μL Stop & Glo©Reagent，测定记录Renilla luciferase值，此即为报告基因发光值，Renilla luciferase值/Firefly luciferase值为荧光素酶相对活性。

1.2.3 流式细胞术 Ficoll-Pague密度梯度离心法分离PBMC，洗涤后加入CD3、CD4、CD57、程序性死亡受体1(programmed death-1，PD-1)表面抗体，4 ℃避光孵育30 min后洗涤，1 500 r/min离心5 min 后弃上清。SIRT1、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3，TIM-3)为胞内染色，用Inside Stain Kit中的固定液4 ℃固定30 min，1 500 r/min离心5 min后弃上清；加破膜液180 μL，1 500 r/min离心5 min后弃上清。加50 μL破膜液，加SIRT1、TIM-3抗体，室温避光孵育30 min，1 500 r/min离心5 min后弃上清，加流式缓冲液，上机检测。

1.2.4 统计学分析 利用SPSS 21.0软件进行统计分析，GraphPad Prism 8.3软件作图，计量资料以¯x±s表示，计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人群PBMCs中CD4+T淋巴细胞计数

流式细胞仪检测各组人群PBMCs中CD4+T淋巴细胞的水平，3组间差异无统计学意义(F=0.46，P=0.63；图1)。

图1 各组人群PBMCs中CD4+T淋巴细胞计数

2.2 CD4+T淋巴细胞上miR-181a、SIRT1、P53及P21的表达情况

采用qRT-PCR检测3组人群CD4+T淋巴细胞上miR-181a，SIRT1、P53、P21mRNA的表达水平，每组8例。结果显示，miR-181a表达倍数变化在3组间差异有统计学意义(F=7.59，P<0.01)，HCV治愈组及HCV组miR-181a表达水平较健康对照组明显下降(P<0.01，图2A)。SIRT1mRNA表达倍数变化在3组间差异有统计学意义(F=9.69，P<0.01)，HCV治愈组及HCV组SIRT1mRNA表达水平较健康对照组明显上升(P<0.05，P<0.01，图2B)。P53mRNA表达倍数的变化在3组间差异有统计学意义(F=6.53，P<0.01)，HCV治愈组及HCV组P53mRNA表达水平较健康对照组明显下降(P<0.05，图2C)。P21mRNA表达倍数变化在3组间差异有统计学意义(F=27.02，P<0.01)，HCV组及HCV治愈组P21mRNA表达水平较健康对照组明显下降(P<0.01，图2D)。

A：miR-181a表达倍数变化，HCV治愈组及HCV组较健康对照组下降；B：SIRT1 mRNA表达倍数变化，HCV治愈组及HCV组较健康对照组上升；C：P53 mRNA表达倍数变化，HCV治愈组及HCV组较健康对照组下降；D：P21 mRNA表达倍数变化，HCV治愈组及HCV组较健康对照组下降。 aP<0.05， bP<0.01 vs健康对照组。图2 CD4+T淋巴细胞上miR-181a，SIRT1、P53及P21 mRNA的表达水平

2.3 双荧光素酶报告基因实验验证miR-181a靶向调控SIRT1的表达

图3A为hsa-miR-181a与h-SIRT1靶位点结合示意图，图3B显示hsa-miR-181a与h-SIRT1-wt共培养，可显著下调荧光素酶的活性(P<0.01)，h-SIRT1突变后这种下调作用消失，说明两者间存在靶向调控作用。

A：hsa-miR-181a与h-SIRT1靶位点结合示意图；B：hsa-miR-181a显著下调h-SIRT1的荧光的表达。 bP<0.01。图3 miR-181a靶向调控SIRT1的表达

2.4 CD4+T淋巴细胞上SIRT1、CD57、PD-1、TIM-3的表达水平

流式细胞仪检测健康对照组(n=12)、HCV治愈组(n=15)、HCV组(n=18)3组人群CD4+T淋巴细胞上SIRT1、CD57、PD-1、TIM-3表达水平。SIRT1在3组间差异有统计学意义(F=10.60，P<0.01)，与健康对照组相比，HCV组SIRT1表达水平明显升高(P<0.01)，经治疗后，HCV治愈组表达水平下降，但与HCV组相比差异无统计学意义，HCV治愈组与健康对照组比较，SIRT1的表达水平显著升高(P<0.05，图4A)。CD57在3组间差异无统计学意义(图4B)。PD-1表达水平在3组间有统计学差异(F=5.31，P<0.01)，其中与健康对照组相比，PD-1在HCV组明显升高(P<0.01)，经治疗后略有下降，HCV治愈组和健康对照组、HCV组相比，差异均无统计学意义(图4C)。TIM-3在3组间差异有统计学意义(F=11.33，P<0.01)，与健康对照组相比，TIM-3在HCV组(P<0.01)、HCV治愈组(P<0.01)升高，HCV治愈组和HCV组相比无统计学差异(图4D)。

A：CD4+T淋巴细胞上SIRT1的表达，HCV治愈组及HCV组较健康对照组上升；B：CD4+T淋巴细胞上CD57的表达，3组间无统计学差异；C：CD4+T淋巴细胞上PD-1的表达，HCV治愈组及HCV组较健康对照组上升；D：CD4+T淋巴细胞上TIM-3的表达，HCV治愈组及HCV组较健康对照组上升。 aP<0.05， bP<0.01 vs健康对照组。图4 CD4+T淋巴细胞上SIRT1、CD57、PD-1、TIM-3的表达水平

3 讨论

研究发现CD4+T细胞衰竭是慢性HCV感染的标志，HCV特异性CD4+T细胞在早期消退和持续感染期间表型相似，分泌类似水平的细胞因子。然而，持续的病毒血症驱动T细胞激活和PD-1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4的表达，阻断T细胞分化[7]。另有研究分析参与DAA临床试验的HCV患者的外周先天和适应性免疫细胞群及T淋巴细胞上趋化因子受体的表达。在开始治疗1～2周内，外周血CD4+T和CD8+T淋巴细胞的浓度显著升高，单核细胞和自然杀伤细胞的浓度无明显升高。同时具有活化表型(人类白细胞抗原HLA-DR+和CD38+)的CD4+和CD8+T淋巴细胞的百分比下降，这些变化在治疗过程中不能持续，治疗结束后恢复到治疗前水平[8]。有研究观察到HCV特异性CD4+T细胞的频率在DAA治疗后2周内增加，虽然Th1表型的细胞在基线时是主要的亚群，但具有滤泡T辅助细胞表型和转录特征的细胞逐渐形成了循环的CD4+T细胞库，同时伴随HCV特异性中和抗体和生发中心活性的下降[9]。本实验检测发现DAA治疗前后，CD4+T淋巴细胞计数在健康对照组、HCV组、HCV治愈组3组人群中并无差异。这可能与HCV感染者收集PBMC时没有按第2、4、8周等时间节点收集有关，尤其是没有获取到治疗早期第2周的CD4+T细胞数据。与文献[8]相一致的是，CD4+T淋巴细胞计数在HCV感染者DAA治疗前后并无差异。

Sirtuin蛋白是高度保守的组蛋白去乙酰基转移酶，具有广泛功能，包括调控转录、细胞周期、细胞分化、凋亡、应激、代谢和基因组稳定性[10]。SIRT1对多种免疫性、肿瘤性及感染性疾病具有显著影响，且在衰老细胞中表达减少[11]。有研究报道HCV core蛋白能抑制HepG2细胞凋亡，诱导SIRT1mRNA和蛋白水平升高，而敲除SIRT1细胞凋亡依旧[12]。我们此前证明HCV慢性感染者外周血CD4+T细胞上miR-181a水平下调，抗衰老蛋白SIRT1上调，过表达miR-181a能下调SIRT1蛋白的表达水平。我们推测HCV感染能抵抗细胞衰老，但是细胞功能下降，不能有效清除HCV，导致HCV感染慢性化[3]。在本研究中，我们进一步证明了miR-181a能结合SIRT1的3′非翻译区，抑制SIRT1表达(图3)，这与文献[13]一致。本研究中HCV组与健康对照组相比，外周CD4+T淋巴细胞上miR-181a下降、SIRT1mRNA表达上升，经过治疗，HCV治愈组miR-181a依然下降(图2A)，且与健康对照组有统计学差异；HCV治愈组SIRT1表达无论是mRNA水平(图2B)还是蛋白水平(图4A)均下降，但与HCV组相比无统计学意义，而与健康对照组有显著性差异。提示HCV感染者经DAA药物治愈后，CD4+T细胞的衰老及功能并未完全恢复，miR-181a下降，导致SIRT1上升，引起P53、P21的下降。

抑癌基因P53通过引起细胞周期阻滞和细胞凋亡来维持基因组的稳定性，P53的乙酰化在细胞衰老中起关键作用。SIRT1蛋白可使P53去乙酰化，削弱P53的作用，进而减少凋亡并延长细胞寿命[14]。P21是P53的靶基因，P21蛋白的过表达可导致细胞周期阻滞，并出现一系列衰老征象[15]。有研究发现慢性HCV感染者中，CD4+T淋巴细胞的端粒长度越短，与肝硬化进展、临床预后不佳越相关[16]。本研究小组此前也发现HCV组比健康对照组的CD4+T淋巴细胞端粒长度更短，衰老细胞更多，然而SIRT1的表达比健康对照组更高[3]。HCV组及HCV治愈组CD4+T淋巴细胞上P53、P21水平较健康对照组下降。推测在HCV感染后，外周循环CD4+T淋巴细胞衰老，导致SIRT1反应性增高，抑制P53、P21的表达，HCV治愈后，CD8+T淋巴细胞衰老状态部分恢复，但与健康对照组仍有差异(图2B～D)。

有学者研究发现HCV特异性CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞高表达PD-1、CD57，且与血浆中HCV病毒载量的水平呈正相关[17]。但在本实验中衰老标志分子CD57在3组间无统计学差异，且在HCV组、HCV治愈组的CD8+T细胞上表达也无差异[6]。本研究中HCV组与健康对照组相比，外周CD4+T淋巴细胞上PD-1、TIM-3表达水平上升，经治疗后，HCV治愈组PD-1表达水平与健康对照组无统计学差异，TIM-3表达虽有所下降，但仍比健康对照组高(图4)。持续性HCV病毒血症导致PD-1持续上调[7]，有实验[18]分析慢性HCV感染者T淋巴细胞的耗竭状态，发现PD-1在HCV肽刺激的CD4+T淋巴细胞上表达上升且有统计学差异，TIM-3在HCV肽刺激的CD4+T淋巴细胞上表达上升，但无统计学差异。该研究认为慢性HCV感染导致CD4+T和CD8+T淋巴细胞功能耗竭，病毒持续感染。本研究提示，HCV组经DAA治疗后，CD4+T淋巴细胞功能部分恢复，PD-1降至与健康对照组无差异，但TIM-3仍比健康对照组高。

综上所述，本研究分析了miR-181a调节HCV感染者DAA治疗前后CD4+T淋巴细胞衰老相关指标的变化。发现HCV组比健康对照组的CD4+T淋巴细胞衰老水平更高，miR-181a水平降低，SIRT1蛋白表达水平升高。经过DAA治疗，获得持续病毒学应答后，HCV治愈组CD4+T细胞上miR-181a表达水平仍与健康对照组有差异；SIRT1蛋白表达水平下降，但与健康对照组仍有差异。HCV组和HCV治愈组的P53、P21表达与健康对照组相比均降低，而HCV治愈组和HCV组相比无统计学差异。HCV感染者CD4+T淋巴细胞上PD-1、TIM-3表达水平升高，经DAA治疗后PD-1、TIM-3表达下降，细胞衰老部分缓解，细胞免疫耗竭功能部分恢复。