睡眠剥夺导致小鼠行为异常及海马小胶质细胞过度活化

刘明月，张洋铭，黄 鑫，成子硕，郭保霖，武胜昔，杨彦玲

(1延安大学医学院生理教研室，陕西 延安 716099；2空军军医大学基础医学院神经生物学教研室，陕西 西安 710032)

睡眠不足是当今社会普遍存在的公共卫生问题，长期睡眠不足导致癌症、猝死、心血管等疾病[1]的发生率显著增高，同时也会引发学习认知能力受损、焦虑抑郁情绪异常等。这些严重地影响人类的生活质量和工作效率，同时降低社会的生产效率。然而，目前睡眠不足导致相关行为异常的机制尚不清晰。既往研究发现6 h睡眠剥夺(sleep deprivation，SD)诱发小鼠前额叶皮层小胶质细胞异常活化引起负性情绪发生[2]，然而其是否同样介导长时程SD诱发的行为异常仍不清楚。因此，建立长时程SD模型、阐明其诱发的相关高级脑功能改变、探究关键脑区小胶质细胞的改变对于理解SD和找寻潜在的干预靶点具有重要的科学意义。

在本研究中，我们成功构建了72 h SD小鼠模型，通过高架十字迷宫实验、旷场实验和新物体识别实验检测SD在焦虑行为表型以及认知记忆中产生的负面影响[3]，进一步利用免疫组化染色结合小胶质细胞形态学分析的方式探究小胶质细胞在该过程中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

成年雄性C57小鼠(20～25 g)16只，每4～6只一笼饲养于特定的无病原体实验动物饲养环境，控制温度为22～24 ℃，饲养环境保持12 h昼夜节律。本研究由空军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准(许可证号：IACUC-20211053)，按照《实验动物饲养和使用指南》(国家卫生研究院出版物第80～123号，1996年修订)进行，将小鼠随机分为SD组和对照组，每组8只。

实验仪器：恒冷冰冻切片机(Lecia CM3050S，德国)；改良多平台SD平台(实验室定制)；旷场(实验室定制)；高架十字迷宫(实验室定制)；共聚焦显微镜(Olympus FV1000，日本)；行为视频分析软件(Panlab SMART 3.0，西班牙)。

1.2 方法

1.2.1 SD动物模型的建立 SD动物模型构建采用改良多平台SD法SD装置[4]，SD装置是一个大小为25 cm×35 cm×16 cm的聚丙烯材质水槽，内置12根间距相同，直径为3 cm、高度为5 cm的木质圆柱，水槽内注有24 ℃温水，水平面在圆柱顶端下1 cm处。小鼠能够在圆柱平台之间自由行动，但无法横跨趴在两根圆柱之间休息，当小鼠进入快速眼动睡眠时，由于四肢肌肉松弛，肌张力降低而触水或落入水中被唤醒，使之保持清醒状态。SD过程中小鼠能够自由地从装置顶端摄取水和食物。在本实验中，SD组小鼠从第1日上午08∶30至第3日上午08∶30进行SD。实验过程中每日更换2次装置内的水以保持水质清洁。对照组小鼠置于没有水的相同装置。SD结束后，用吸水纸巾轻轻擦去小鼠身上的水迹，进行后续的行为学实验。

1.2.2 动物行为学检测

1.2.2.1 高架十字迷宫实验及数据分析 将小鼠提前4 h放入实验等待区适应环境。实验区与外界隔音，光照均匀，亮度为20 lx，环境温度维持在(22.0±0.5) ℃。实验装置由两个开放臂(25 cm×8 cm×12 cm)和两个封闭臂(25 cm×8 cm×12 cm)组成。实验时轻柔地将小鼠从饲养笼子中取出，放入高架十字中心区域，确保小鼠头部朝向开放臂的方向。释放小鼠同时进行数据采集，视频录制5 min[5]。每只小鼠测试结束后清理粪便、尿液后使用750 mL/L乙醇去除气味，待实验设备完全干燥后进行下一个实验，整个实验过程保持环境安静。采用头-体-尾三点法分析小鼠运动轨迹，使用SMART 3.0统计开臂进入次数、开臂滞留时间。

1.2.2.2 旷场实验及数据分析 旷场实验在一个空旷的正方形箱体(50 cm×50 cm×50 cm)中进行。测试开始时，将每只小鼠放置在角落中，并通过位于旷场上方的摄像机记录5 min[6]。每次实验后，用750 mL/L乙醇清理小鼠排泄物，擦洗旷场内壁及缝隙。用SMART 3.0统计分析小鼠进入旷场中心区域的次数、在中心区探索滞留花费的时间以及运动的总距离。旷场的中心面积为总面积的25%(约25 cm×25 cm的正方形)。

1.2.2.3 新物体识别实验及数据分析 72 h SD后，我们对小鼠进行新物体识别实验。将两个相同但对于小鼠完全陌生的物块放至距正方形箱体测内壁10 cm处[7]。物块在放入前用750 mL/L乙醇喷洗干净并晾干。实验包括适应、学习和测试三个阶段。适应阶段将小鼠放入旷场中对旷场的环境进行5 min的适应；学习阶段让小鼠对两个形状以及颜色相同的物块进行10 min的学习；测试阶段将学习阶段的一个物块用形状、颜色均不相同的新物块进行替代。实验在20∶00～23∶00区间(夜晚周期)进行，轻柔地将小鼠放置在旷场的一角后开始录制。利用SMART 3.0软件分析小鼠对物块探索时间。

1.2.3 组织处理及免疫荧光染色

1.2.3.1 动物组织获取及处理 行为学实验结束后，利用50 mL/L异氟烷对小鼠进行气体麻醉，同时用手术剪刀剪开其胸腔，暴露心脏。用一次性注射器吸取0.01 mol/L PBS 15 mL，将针尖插入小鼠心脏左心室，剪开右心耳后推入PBS置换血液。待小鼠肝脏泛白后，换成预冷的40 mL/L多聚甲醛，灌注约100 mL。待小鼠全身僵硬后，小心剪开其头皮及颅骨，暴露鼠脑，用镊子完整取出大脑组织放入装满40 mL/L多聚甲醛的离心管中，并于4 ℃冰箱过夜。固定结束后，将组织转移至配好的300 g/L蔗糖溶液中脱水，置于4 ℃冰箱保存。从蔗糖中取出鼠脑，用冰冻包埋剂包埋，在恒冷冰冻切片机中，进行连续冠状切片，片厚50 μm，将包含海马脑区的组织切片收集入0.01 mol/L PBS中备用。用PBS漂洗组织3次后，将其转移入冰冻保护液中，置于-20 ℃保存。

1.2.3.2 免疫荧光染色 从冰冻保护液中取出切片，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。将组织切片挑出放入抗体孵育板中，加入50 mL/L驴血清，室温下封闭2 h。而后转移至Goat-anti-Iba1(# 011-27991，1∶500，Wako)一抗中，4 ℃孵育过夜。孵育结束后使用PBS漂洗3次，每次10 min。而后在室温下将组织切片转移至Alexa 594-conjugated Donkey-anti-Goat(A-11058，1∶500，Invitrogen)二抗中避光孵育3 h。结束后用PBS漂洗3次，每次10 min。染色后将脑片裱在载玻片上，而后利用防淬灭荧光封片剂进行封片保存。

1.2.4 小胶质细胞面积分析 使用40倍共聚焦显微镜(FV1000，Olympus公司)采集小胶质细胞图像(Z轴方向每0.5 μm拍摄1张)。每组共追踪到海马背侧CA1脑区细胞带临近区域的10个完整小胶质细胞。采集图片后使用ImageJ软件的NeuronJ插件对神经元形态进行描绘。细胞面积测量方法同之前的研究，利用插件进行计算[8]。进一步对小胶质细胞数量计数并进行统计分析。

2 结果

2.1 SD导致小鼠焦虑样行为改变

为了探究SD是否会导致小鼠出现焦虑样情绪，在小鼠进行SD后对其进行高架十字迷宫检测和旷场实验检测。在高架十字迷宫实验中(图1A)，使用SMART 3.0软件中的头-体-尾三点法分析小鼠运动轨迹，并绘制出小鼠运动轨迹图(图1B)。结果发现对照组小鼠在开放臂区域存在一定的探索行为，而SD组小鼠进入开放臂的时间显著少于对照组小鼠(P<0.05,图1C～D)。同时，SD组小鼠进入开放臂的次数较对照小鼠显著降低(P<0.01,图1E)。

A：72 h SD示意图及高架十字迷宫行为实验示意图；B：小鼠在高架十字迷宫中的典型轨迹图；C:小鼠在高架十字迷宫实验中滞留在开放臂的时间栅状图；D：两组小鼠开放臂探索停留时间比较两组小鼠进入开放臂探索次数比较睡眠剥夺。图1 成年SD小鼠在高架十字迷宫中的行为学改变

在旷场实验中(图2A)，同样利用SMART 3.0软件对录像结果进行分析，使用4×4分割法，将旷场等分为16个区域，界定中间4个区域为旷场的中心区域(图2B)，并绘制出小鼠在旷场实验中的运动轨迹图(图2C)，结果显示，SD组小鼠进入旷场中间区域探索的时间显著少于对照组小鼠(P<0.01,图2D)；SD组小鼠进入旷场中间区域的次数显著少于对照组小鼠(P<0.01,图2E)；SD组小鼠在旷场的运动总路程降低(图2F)；两组小鼠进入旷场中间区域探索行为存在差异(图2G)。以上行为学实验证明，SD会导致小鼠出现明显的焦虑样行为。

A：72 h SD示意图及旷场行为实验流程图；B：4×4分析法中旷场中心区域示意图；C：小鼠在旷场实验中的典型轨迹图；D：SD小鼠进入中间区域探索停留的时间小鼠进入中间区域探索的次数F：SD小鼠在旷场运动的总路程降低小鼠在旷场中心区域的探索情况。SD：睡眠剥夺。图2 成年SD小鼠在旷场实验中的行为学改变

2.2 SD导致小鼠出现认知记忆功能的改变

为了探究SD对认知功能的影响，我们对小鼠进行了新物体识别实验检测(图3A～B)。结果发现，在第2日测试阶段，对照组小鼠对新物体出现了明显的识别偏好，探索时间明显高于旧物体(P<0.01)；而SD组小鼠则对新物体无明显偏好，且对新、旧物体的探索时间无明显差异(图3C)。计算其偏好指数发现，SD组小鼠对新物体的偏好指数明显低于对照组小鼠(P<0.01,图3D)。以上结果证明，SD损伤了小鼠对新事物的认知功能。

A：新物体识别实验流程图；B：新物体识别实验模式图；C：小鼠对新旧物体探索的时间识别指数(小鼠探索新物体时间/新旧物体时间之和)睡眠剥夺。图3 成年SD小鼠在新物体识别实验中的行为学改变

2.3 SD诱导海马区域小胶质细胞异常激活

海马是情绪及认知编码的重要脑区。72 h SD后，我们对两组小鼠进行灌注取材，而后进行了海马区域免疫组织荧光染色，标记表达Iba1的小胶质细胞并进行三维重塑及形态学分析(图4A)。通过分析小胶质细胞树突分支与不同半径同心圆的交叉点数显示，总体交叉点数SD组显著高于对照组(P<0.01,图4B～C)，平均交叉点数SD组也显著高于对照组(P<0.01,图4D)；且通过分析小胶质细胞的面积和数量，发现海马区域SD组小胶质细胞的细胞数量及细胞面积均相较于对照组出现了明显增高(P<0.05，P<0.01，图4E～F)。上述结果初步证实了SD能够诱发海马区域小胶质细胞出现异常激活，可能参与了SD诱发情绪及认知异常的发生发展。

A：小胶质细胞的三维重建(标尺为20 μm)；B～C：Sholl分析中小胶质细胞树突分支与不同半径同心圆的交叉点数分析结果中小胶质细胞突起的平均分支数海马中Iba1阳性细胞的数量(每组n=10个细胞/8只小鼠)小胶质细胞面积的定量(每组n=10个细胞/8只小鼠)睡眠剥夺。图4 SD对小鼠海马中的小胶质细胞形态的影响

3 讨论

SD严重影响身心健康。临床研究和动物实验发现睡眠不足会诱发负性情绪及认知功能不可逆的损害，然而相关机制尚未完全阐明[9-10]。研究表明，SD对机体的影响与免疫炎症反应密切相关。其主要通过影响下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感神经系统，引起机体炎症反应。在啮齿类相关研究中发现，SD能够打破机体促炎及抗炎平衡稳态，同时大量的炎症因子如TNF-α、IL-1β等表达增加[11]。因此从神经免疫炎症角度入手是探寻SD潜在神经机制的重要方向。

睡眠在调节认知和情绪方面发挥着重要作用。早在1983年研究者就提出了睡眠对记忆巩固过程至关重要，随着研究的不断深入，睡眠和记忆的关系被广泛证实。海马和额叶与情绪认知有很大的关系[12]，海马是调节记忆的经典脑区，额叶与情绪调节有关。大量研究表明，睡眠不足会导致认知功能的损害，同时会导致学习、记忆能力下降[13-16]。据ESTRADA等[17]研究报道，SD对机体的空间学习记忆有一定的损伤。TUAN等[18]通过新物体识别实验发现SD对小鼠短期记忆同样有不良的影响。在本研究中，SD后的小鼠同样表现出记忆能力的降低，即在新物体识别实验中，SD组的小鼠无法区分出新旧物体，这与以往的报道相一致[19]。另外，既往研究表明SD与焦虑等情绪相关，SD会导致动物出现明显的焦虑状态，且在完全SD的状态下也有相似的结果[20]。本研究中的结果与其报道一致，72 h SD后，SD组小鼠在高架十字迷宫中进入开放臂的次数及其滞留于开放臂的时间均低于对照组小鼠，提示SD小鼠表现出了明显的焦虑样行为。此外，72 h SD后的小鼠，在旷场实验中进入旷场中心区域的次数、滞留于中心区域的时间以及运动的总距离显著低于对照组小鼠。

研究表明，大鼠认知功能的损伤与PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达上调有关[21]。SD加重小鼠海马区域Aβ斑块沉积和小胶质细胞激活，降低了海马区PSD-95的表达，导致小鼠的短期工作记忆、长时程空间参考记忆和恐惧记忆等多种类型的认知损伤加重[22]。在本研究中，我们从形态学角度验证了SD会导致海马小胶质细胞的过度活化，而活化的小胶质细胞是否会进一步通过对神经突触的异常修剪等过程影响局部神经环路功能稳态，进而造成行为异常仍需要进一步探索。

本研究存在一定的局限性：①相关认知检测仅限于空间位置记忆，后续还需对SD导致恐惧、文字等记忆形式认知受损进行进一步的探索验证；②对小胶质细胞的观察仅限于形态学，后续需从信号通路、胶质细胞-神经元交互等角度做进一步的机制研究。

综上所述，本研究结果表明，72 h SD会导致小鼠出现焦虑样行为的改变以及认知功能的障碍，海马CA1小胶质细胞发生了过度活化。探明小胶质细胞参与SD诱发行为异常发生的机制、建立靶向过度活化的小胶质细胞干预策略将对未来防治SD对高级脑功能的影响具有重要意义。