罗非鱼骨发酵制备胶原蛋白肽工艺的响应面优化

◎ 韦倩妮

（北海职业学院，广西 北海 536000）

我国罗非鱼养殖量居世界前列，销售和加工量大。在加工过程中，产生鱼骨、鱼片、鱼鳞等大量下脚料，约占鱼体的54%，其中鱼头、鱼骨约占43%，占比最多[1]。我国水产品加工和副产物综合利用的水平较低，若这些下脚料没有得到有效利用，会造成资源浪费，甚至污染环境。随着渔业的发展，鱼类下脚料的高值化利用逐渐引起人们的重视，不少学者开展了研究。鱼皮、鱼头、鱼骨等部位常用于制备活化钙，提取明胶、蛋白多肽和硫酸软骨素等活性物质，也可制成即食鱼排等各类休闲食品[2]。

制备蛋白肽常用酶解法和发酵法，通过微生物发酵法提取多肽，可充分发挥微生物胞外酶对蛋白质水解的作用，还可以利用其发酵过程产生的各种酶来分解脂肪和腥味物质[3]。枯草芽孢杆菌是一种传统食品用菌，具有良好的产酶能力。本文以罗非鱼骨、鱼头制备鱼骨浆原料，用枯草芽孢杆菌发酵，制备胶原蛋白肽。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼，市售。枯草芽孢杆菌，北海职业学院食品检验检测团队选育；牛肉膏、蛋白胨，北京奥星生物技术有限公司；牛血清蛋白、福林酚酚试剂，北京索莱宝科技有限公司；酒石酸钾钠、无水硫酸铜、氢氧化钠、碳酸钠和磷酸氢二钾，广东省化学试剂工程技术研究开发中心；三氯乙酸，福晨天津化学试剂有限公司。培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，调节pH 值至7.4～7.5，用于种子液制备。

1.2 仪器与设备

HWS-12 恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；250B 振荡培养箱，金坛市宏华仪器厂；UV1000紫外分光光度计，上海翱艺仪器有限公司；TD-4Z 离心机，四川蜀科仪器有限公司；YXQ-LS-50S Ⅱ高压灭菌锅、SW-CJ-2FD 超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 种子液的制备

将枯草芽孢杆菌活化，接种于种子液培养基中，置于37 ℃培养箱中，振荡培养24 h。

1.3.2 鱼骨胶原蛋白肽水解液的制备

罗非鱼去鳞、去皮、去肉，清除内脏，将鱼体清洗干净，鱼头、鱼骨下脚料绞碎，得到鱼骨浆。分别称取一定质量的鱼骨浆和水于三角瓶中，用高压灭菌锅121 ℃灭菌20 min，得到发酵培养基。冷却后，将枯草芽孢杆菌种子液接入发酵培养基中，置于一定温度的培养箱，振荡培养一定时间。将发酵液8 500 r·min-1离心10 min，收集上清，于98 ℃水浴5 min，灭酶，得到水解液。

1.3.3 单因素试验

分别考察种子液接种量（3%、5%、7%、9%和11%）、发酵温度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃）、鱼骨浆添加量（8%、10%、12%、14%和16%）、发酵时间（18 h、24 h、30 h、36 h 和42 h）等4 个因素对水解度的影响。按照1.3.2 方法制备水解液，取上清，测定水解度。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选取接种量、发酵温度、鱼骨浆添加量3 个因素进行优化，因素和水平见表1。

表1 响应面实验因素水平表

1.3.5 测定方法

鱼骨浆总蛋白的测定采用凯氏定氮法（GB/T 5009.5—2016）。蛋白肽含量的测定采用福林-酚法测定，水解度采用TCA 法[4]。

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式中：N0为鱼骨浆总蛋白的含量，g/100 g；N1为水解前可溶性多肽的含量，g/100 g；N2为水解后可溶性多肽的含量，g/100 g。

2 结果与分析

2.1 接种量对水解度的影响

由图1可知，接种量为7%时，水解度最大。当接种量较小时，菌量不足，发酵水平不高；随着接种量增大，胞外酶分泌量增多，发酵周期短[3]，但接种量过多，代谢废物亦随之增多，不利于发酵，导致水解度低[5]。

图1 不同接种量对水解度的影响图

2.2 发酵温度对水解度的影响

由图2结果可知，温度在35 ℃左右时，水解度最大。发酵温度过高时，加剧了胶原蛋白肽链的断裂，从而产生大量肽链片段[5]。

图2 不同发酵温度对水解度的影响图

2.3 鱼骨浆添加量对水解度的影响

由图3结果可知，当鱼骨浆添加量为12%时，水解度最大。当鱼骨浆添加量少时，培养基所含水分较多，枯草芽孢杆菌所产生的胞外酶被稀释，影响酶的作用效果，降低水解效果[3]。

图3 鱼骨浆添加量对水解度的影响图

2.4 发酵时间对水解度的影响

由图4结果可知，随着发酵时间延长，水解度增大，当发酵30 h 以后，水解度变化不大；发酵时间过长，发酵液会有异味。

图4 不同发酵时间对水解度的影响图

2.5 响应面试验优化工艺条件

2.5.1 回归模型建立与方差分析

在确定单个因素适宜的范围后，选取接种量（A）、发酵温度（B）和鱼骨浆添加量（C）为试验因素，水解度（Y）为评价指标，用Design-Expert 11 进行Box-Benhken 试验设计和数据分析，结果见表2，显著性检验和方差分析结果见表3。通过回归分析，得到回归方程Y=27.77+1.07A+1.04B+1.09C-0.367 5AB-0.482 5AC+1.32BC+1.32A2-1.60B2-0.948 5C。

表2 罗非鱼骨发酵制备胶原蛋白肽艺优化响应面试验设计与结果表

表3 回归模型方差分析表

由表3可知，此模型的P＜0.01，说明此模型极显著。失拟项P=0.380 9，大于0.05，失拟项不显著，说明该模型的拟合程度比较好，与实际情况较吻合。同时模型的复决定系数R2=0.973 1，变异系数CV=1.87%，说明该模型的预测结果有较高的精密度及可靠性。由P值可知，除二次项C²、相互项AB、AC对水解度无显著影响外，其他项A、B、C、A²、B²、BC对水解度有显著影响。根据F值大小，水解度受各因素影响的顺序为C（鱼骨浆添加量）>A（接种量）>B（发酵温度）。

2.5.2 响应面图形分析与最佳工艺确定

各个因素的交互作用响应曲面图如图5所示。由图5可知，当接种量、发酵温度、鱼骨浆添加量取值较小时，效应曲面较陡，对水解度影响比较显著。各交互作用中，接种量（A）与发酵温度（B），接种量（A）与鱼骨浆添加量（C）的等高线接近圆形，交互作用不显著，发酵温度（B）与鱼骨浆添加量（C）的等高线为椭圆，交互作用显著。通过软件分析，得到水解的最佳工艺条件为接种量7.80%、发酵温度36.59 ℃、鱼骨浆添加量13.28%，在此条件下水解度的预测值为28.57%。为验证响应面试验预测结果的可靠性，并结合实际生产需要，将最优工艺参数调整为接种量7.8%、发酵温度36.6 ℃、鱼骨浆添加量13.3%，发酵时间30 h。按优化的条件进行3 次重复试验，水解度的平均值为28.52%，与模型的预测值接近，说明本试验优化的方法可行。

图5 接种量、发酵温度、鱼骨浆添加量交互作用对水解度影响的响应面图

3 结论

罗非鱼加工中产生的鱼骨、鱼头等下脚料占比较大，如果仅作用于生产传统饲料，利用价值较低。本研究以鱼骨浆为原料、水解度为评价指标，通过单因素试验筛选，用响应面试验优化水解的工艺条件，结果为接种量7.8%、发酵温度36.6 ℃、鱼骨浆添加量13.3%，发酵时间30 h。在此条件下，水解度可达28.52%。本试验为水产品加工下脚料的高值化利用提供了参考，具有应用价值。