罗非鱼骨发酵制备胶原蛋白肽工艺的响应面优化

2022-12-27 02:04韦倩妮
现代食品 2022年21期
关键词:鱼骨罗非鱼枯草

◎ 韦倩妮

(北海职业学院,广西 北海 536000)

我国罗非鱼养殖量居世界前列,销售和加工量大。在加工过程中,产生鱼骨、鱼片、鱼鳞等大量下脚料,约占鱼体的54%,其中鱼头、鱼骨约占43%,占比最多[1]。我国水产品加工和副产物综合利用的水平较低,若这些下脚料没有得到有效利用,会造成资源浪费,甚至污染环境。随着渔业的发展,鱼类下脚料的高值化利用逐渐引起人们的重视,不少学者开展了研究。鱼皮、鱼头、鱼骨等部位常用于制备活化钙,提取明胶、蛋白多肽和硫酸软骨素等活性物质,也可制成即食鱼排等各类休闲食品[2]。

制备蛋白肽常用酶解法和发酵法,通过微生物发酵法提取多肽,可充分发挥微生物胞外酶对蛋白质水解的作用,还可以利用其发酵过程产生的各种酶来分解脂肪和腥味物质[3]。枯草芽孢杆菌是一种传统食品用菌,具有良好的产酶能力。本文以罗非鱼骨、鱼头制备鱼骨浆原料,用枯草芽孢杆菌发酵,制备胶原蛋白肽。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼,市售。枯草芽孢杆菌,北海职业学院食品检验检测团队选育;牛肉膏、蛋白胨,北京奥星生物技术有限公司;牛血清蛋白、福林酚酚试剂,北京索莱宝科技有限公司;酒石酸钾钠、无水硫酸铜、氢氧化钠、碳酸钠和磷酸氢二钾,广东省化学试剂工程技术研究开发中心;三氯乙酸,福晨天津化学试剂有限公司。培养基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,调节pH 值至7.4~7.5,用于种子液制备。

1.2 仪器与设备

HWS-12 恒温水浴锅,上海齐欣科学仪器有限公司;250B 振荡培养箱,金坛市宏华仪器厂;UV1000紫外分光光度计,上海翱艺仪器有限公司;TD-4Z 离心机,四川蜀科仪器有限公司;YXQ-LS-50S Ⅱ高压灭菌锅、SW-CJ-2FD 超净工作台,上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 种子液的制备

将枯草芽孢杆菌活化,接种于种子液培养基中,置于37 ℃培养箱中,振荡培养24 h。

1.3.2 鱼骨胶原蛋白肽水解液的制备

罗非鱼去鳞、去皮、去肉,清除内脏,将鱼体清洗干净,鱼头、鱼骨下脚料绞碎,得到鱼骨浆。分别称取一定质量的鱼骨浆和水于三角瓶中,用高压灭菌锅121 ℃灭菌20 min,得到发酵培养基。冷却后,将枯草芽孢杆菌种子液接入发酵培养基中,置于一定温度的培养箱,振荡培养一定时间。将发酵液8 500 r·min-1离心10 min,收集上清,于98 ℃水浴5 min,灭酶,得到水解液。

1.3.3 单因素试验

分别考察种子液接种量(3%、5%、7%、9%和11%)、发酵温度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃)、鱼骨浆添加量(8%、10%、12%、14%和16%)、发酵时间(18 h、24 h、30 h、36 h 和42 h)等4 个因素对水解度的影响。按照1.3.2 方法制备水解液,取上清,测定水解度。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上,选取接种量、发酵温度、鱼骨浆添加量3 个因素进行优化,因素和水平见表1。

表1 响应面实验因素水平表

1.3.5 测定方法

鱼骨浆总蛋白的测定采用凯氏定氮法(GB/T 5009.5—2016)。蛋白肽含量的测定采用福林-酚法测定,水解度采用TCA 法[4]。

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式中:N0为鱼骨浆总蛋白的含量,g/100 g;N1为水解前可溶性多肽的含量,g/100 g;N2为水解后可溶性多肽的含量,g/100 g。

2 结果与分析

2.1 接种量对水解度的影响

由图1可知,接种量为7%时,水解度最大。当接种量较小时,菌量不足,发酵水平不高;随着接种量增大,胞外酶分泌量增多,发酵周期短[3],但接种量过多,代谢废物亦随之增多,不利于发酵,导致水解度低[5]。

图1 不同接种量对水解度的影响图

2.2 发酵温度对水解度的影响

由图2结果可知,温度在35 ℃左右时,水解度最大。发酵温度过高时,加剧了胶原蛋白肽链的断裂,从而产生大量肽链片段[5]。

图2 不同发酵温度对水解度的影响图

2.3 鱼骨浆添加量对水解度的影响

由图3结果可知,当鱼骨浆添加量为12%时,水解度最大。当鱼骨浆添加量少时,培养基所含水分较多,枯草芽孢杆菌所产生的胞外酶被稀释,影响酶的作用效果,降低水解效果[3]。

图3 鱼骨浆添加量对水解度的影响图

2.4 发酵时间对水解度的影响

由图4结果可知,随着发酵时间延长,水解度增大,当发酵30 h 以后,水解度变化不大;发酵时间过长,发酵液会有异味。

图4 不同发酵时间对水解度的影响图

2.5 响应面试验优化工艺条件

2.5.1 回归模型建立与方差分析

在确定单个因素适宜的范围后,选取接种量(A)、发酵温度(B)和鱼骨浆添加量(C)为试验因素,水解度(Y)为评价指标,用Design-Expert 11 进行Box-Benhken 试验设计和数据分析,结果见表2,显著性检验和方差分析结果见表3。通过回归分析,得到回归方程Y=27.77+1.07A+1.04B+1.09C-0.367 5AB-0.482 5AC+1.32BC+1.32A2-1.60B2-0.948 5C。

表2 罗非鱼骨发酵制备胶原蛋白肽艺优化响应面试验设计与结果表

表3 回归模型方差分析表

由表3可知,此模型的P<0.01,说明此模型极显著。失拟项P=0.380 9,大于0.05,失拟项不显著,说明该模型的拟合程度比较好,与实际情况较吻合。同时模型的复决定系数R2=0.973 1,变异系数CV=1.87%,说明该模型的预测结果有较高的精密度及可靠性。由P值可知,除二次项C²、相互项AB、AC对水解度无显著影响外,其他项A、B、C、A²、B²、BC对水解度有显著影响。根据F值大小,水解度受各因素影响的顺序为C(鱼骨浆添加量)>A(接种量)>B(发酵温度)。

2.5.2 响应面图形分析与最佳工艺确定

各个因素的交互作用响应曲面图如图5所示。由图5可知,当接种量、发酵温度、鱼骨浆添加量取值较小时,效应曲面较陡,对水解度影响比较显著。各交互作用中,接种量(A)与发酵温度(B),接种量(A)与鱼骨浆添加量(C)的等高线接近圆形,交互作用不显著,发酵温度(B)与鱼骨浆添加量(C)的等高线为椭圆,交互作用显著。通过软件分析,得到水解的最佳工艺条件为接种量7.80%、发酵温度36.59 ℃、鱼骨浆添加量13.28%,在此条件下水解度的预测值为28.57%。为验证响应面试验预测结果的可靠性,并结合实际生产需要,将最优工艺参数调整为接种量7.8%、发酵温度36.6 ℃、鱼骨浆添加量13.3%,发酵时间30 h。按优化的条件进行3 次重复试验,水解度的平均值为28.52%,与模型的预测值接近,说明本试验优化的方法可行。

图5 接种量、发酵温度、鱼骨浆添加量交互作用对水解度影响的响应面图

3 结论

罗非鱼加工中产生的鱼骨、鱼头等下脚料占比较大,如果仅作用于生产传统饲料,利用价值较低。本研究以鱼骨浆为原料、水解度为评价指标,通过单因素试验筛选,用响应面试验优化水解的工艺条件,结果为接种量7.8%、发酵温度36.6 ℃、鱼骨浆添加量13.3%,发酵时间30 h。在此条件下,水解度可达28.52%。本试验为水产品加工下脚料的高值化利用提供了参考,具有应用价值。

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