甲状腺疾病动物模型的研究进展

夏宗霄,刘海鹏,张艳娇,范 源

(1.云南中医药大学中药学院,昆明 650500;2.云南中医药大学第二附属医院,昆明 650216)

目前全球范围内甲状腺疾病患病率显著增加,甲状腺疾病在临床上主要分为甲状腺功能减退症(甲减)、甲状腺功能亢进症(甲亢)、桥本甲状腺炎(hashimoto’s thyroiditis,HT)、甲状腺癌等,但其具体的发病机理仍尚未明确。甲状腺疾病作为临床上常见的内分泌疾病,其疾病的发生、发展与诸多因素有关,目前公认的主要疾病影响包括年龄、性别、吸烟、碘缺乏或碘过量、应激、遗传、自身免疫、环境等因素[1]。具调查统计甲减和亚临床甲减的患病率分别约为0.1%～2%和4%～10%[2],其中甲减患者的甲状腺激素分泌与合成不足,亚临床甲减患者的甲状腺激素在正常范围,但促甲状腺激素含量偏高,且会出现甲状腺肿大等症状。在欧洲和美国,甲亢的患病率大致相似分别为0.7%和0.5%[3],亚甲亢的患病率为0.4%～11%不等[4],其中甲亢患者甲状腺激素分泌与合成偏高,而亚甲亢患者甲状腺激素在正常范围,但促甲状腺激素含量偏低。HT是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD),AITD是一种甲状腺组织自身免疫紊乱的疾病,临床上表现为滤泡细胞萎缩、淋巴细胞浸润、甲状腺肿和纤维化。据统计AITD女性发病率为每1千人3.5～5例,而男性发病率为每1千人0.6～1例[5]。过去30年里,全球甲状腺癌的发病率显著增加,由1975年每10万人5例增加到2015年每10万人15例,特别是乳头状甲状腺癌,约占甲状腺癌的85%[6]。目前关于甲状腺疾病动物模型研究较少,对甲状腺疾病的造模还处于一个逐步成熟的阶段,关于甲状腺疾病的病因、病理等尚未完全明确。因此建立重复性高、稳定性好的甲状腺疾病动物模型,对深入研究甲状腺疾病的发病机制以及早期的干预有着十分重要的意义。本文在查阅大量文献的同时结合团队前期造模经验对甲状腺疾病动物模型做一总结归纳,以期为相关实验的开展提供理论依据。

1 甲状腺功能减退(甲减)模型的建立

1.1 药物诱导的甲减模型

通常使用丙硫氧嘧啶(PTU)或甲巯咪唑(MMI)等抗甲状腺药物,减少机体甲状腺激素的合成建立甲减模型。Sun等[7]喂养雌性SD大鼠含PTU(2mg/(kg·d))的饮用水6周,观测到大鼠行动迟缓且毛发变成棕黄色,用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测其血清水平,与正常组相比,甲减组血清T3、T4偏低,TSH偏高(P＜0.01)。Li等[8]喂养雄性Wistar大鼠甲减组含MMI的饮用水(60mg/(kg·d))12周,测得血清T3、T4显著降低(P＜0.001),TSH升高(P＜0.01)。

药物诱导甲减是最常用的造模方法,且造模难度较小,成功率高。但若想要持续维持甲减状态,需连续不间断给予促甲状腺素药物维持高激素水平,否则药物会在体内逐渐消除使机体功能恢复正常。

1.2 甲状腺切除术甲减模型

Lee等[9]将6周龄雄性SD大鼠分别进行甲状腺切除手术和垂体切除手术,并设立相同数量的假手术组。经过1周的手术适应期后,用ELISA法检测其血清水平,发现甲状腺切除组与其假手术相比血清T3、T4降低,TSH升高(P＜0.05);垂体切除组与其假手术相比血清T3、T4、TSH均有所降低(P＜0.05)。Li等[8]对雄性Wistar大鼠进行甲状腺切除手术,测得血清T3、T4显著降低(P＜0.01),TSH升高(P＜0.05)。

用手术切除甲状腺造模比药物诱导耗时更短,但难度较高,手术不当容易造成大鼠死亡,若甲状腺切除不完全会对血清测定结果造成影响。

1.3 低碘诱导甲减模型

Alayoubi等[10]将SD大鼠随机分为两组,低碘组给予碘缺乏鼠粮(含20μg/kg碘化物),对照组给予碘正常鼠粮(含200μg/kg碘化物),喂养观察17个月。1个月后测得碘缺乏组血清T3、T4水平显著降低(P＜0.001),在10月时达到最低值,血清TSH则呈上升趋势,在9～12个月时达到最大值(P＜0.001)。因SD大鼠处于生长期,其甲状腺重量总是与年龄和体重呈正比,故采取超声三维成像来测量甲状腺体积占体重的比率,取平均值。经计算发现,在第8个月和第14个月时,该数值是对照组的两倍(P＜0.05)。Hu等[11]将BALB/c小鼠随机分为两组:低碘组给予碘浓度为20～40mg/kg的低碘饲料,对照组给予碘浓度为300mg/kg的标准饲料,饲养观察3个月。采用ELISA法测得低碘组血清T3、T4水平显著降低,TSH升高(P＜0.001)。用HE染色法检测缺碘小鼠的甲状腺组织,发现滤泡细胞肿大并呈柱状,免疫组织化学结果显示甲状腺激素转运体8(monocarboxylate transporter8,MCT8)在甲状腺滤泡细胞胞浆中有较高的表达。经实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测,低碘组MTC8mRNA表达明显增高,为对照组的1.36倍(P＜0.01)。

低碘建立甲减模型较为简单,但用时较长。需要注意的是不能完全除碘,因为提供绝对不含碘的鼠粮会直接影响大鼠的正常发育以及器官功能,且大鼠可能无法在研究期间存活。

2 甲状腺功能亢进(甲亢)模型的建立

通常使用左甲状腺素等药物提高机体甲状腺激素的合成,诱导甲亢模型的产生。Jeddi等[12]将雄性Wistar大鼠随机分为甲亢组和对照组。在甲亢组的饮用水中添加左甲状腺素(12mg/L),对照组给予蒸馏水,连续喂养21d。结果表明,甲亢组血清T3、T4水平显著升高,TSH显著降低(P＜0.001)。Venediktova等[13]对甲亢组雄性Wistar大鼠进行腹腔注射左甲状腺素(100μg/100g),共计5d;对照组注射同等体积的生理盐水。发现甲亢组血清T3和T4分别比对照组增加了3倍和4倍(P＜0.05)。刘树民等[14]分别对雌性SD大鼠灌胃左甲状腺素以及尾静脉注射小肠结肠炎耶尔森氏菌进行甲亢造模,发现左甲状腺素组造模初期T3、T4、FT3、FT4显著升高(P＜0.05),但1周后各激素水平随即恢复正常,经HE染色观察到甲状腺滤泡大小基本一致,滤泡胶质染色均匀,滤泡间质无水肿,与空白对照组无显著性差异。分别于第7、14、25天检测小肠结肠炎耶尔森氏菌模型组血清水平,发现在第7天时,血清T3、T4显著升高(P＜0.05),TSH无明显差异,直到第25天时TSH明显升高,差异有统计学意义,经HE染色观察到甲状腺滤泡破坏,上皮细胞轻度增生且有少量的炎细胞存在。

3 桥本甲状腺炎模型的建立

3.1 自发性甲状腺炎模型

大部分自发性甲状腺炎造模所选取的实验动物是NOD.H-2h4小鼠。NOD.H-2h4小鼠在NOD遗传背景下表达H-2K和I-Ak基因,此种主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的单倍型(H-2K)是桥本甲状腺炎的易感性单倍型,因此NOD小鼠发生HT概率很高[15]。Braley-Mullen等[16]喂养7～8周龄的NOD.H-2h4小鼠0.05%碘化钠饮用水23周,在第6周时所有小鼠均发生了HT,第8周时炎症达到最大程度,IgG1和IgG2b抗体水平明显升高(P＜0.05)。He等[17]喂养5周龄NOD.H-2h4小鼠0.05%碘化钠饮用水,分别于2、4、8周对其甲状腺组织进行HE染色,发现甲状腺细胞在第2周开始凋亡(P＜0.001),在第4周NOD.H-2h4小鼠表现出HT,喂养16周后炎症评分、抗甲状腺球蛋白抗体(anti-thyroglobulin antibody,TG-Ab)水平明显高于对照组(P＜0.001)。

该种模型造模成功率极高,实验操作十分简单,但疾病周期较长,需在SPF清洁等级下IVC独立通气笼中喂养,若是动物发生死亡会耗费大量的时间和金钱成本。

3.2 外源性甲状腺抗原免疫法

甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)是HT患者中过度表达的主要抗原,该种蛋白分子在甲状腺中含量特别丰富,占总蛋白的75%～80%[18]。研究表明不同鼠类H-2基因不同,对桥本甲状腺炎的易感性也不尽相同。高应答的如CBA/J(H-2k)和SJL/J(H-2s)种系鼠;而低应答如BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)种系鼠[19]。Wang等[20]将4周龄CBA/J雌性小鼠随机分为两组,模型组皮下注射200μg被 完 全 弗 氏 佐 剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)乳化的鼠甲状腺球蛋白(murine thyroglobulin,mTg)进行初次免疫,两周后用相同剂量的m Tg在不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant,IFA)乳化下进行加强免疫,而对照组组小鼠则用相同剂量的磷酸盐缓冲盐水代替mTg免疫小鼠。结果表明对照组小鼠甲状腺滤泡均匀分布,无萎缩;而模型组小鼠甲状腺滤泡无序排列且伴有淋巴细胞浸润。具计算模型组小鼠HT的成膜率为85.70%,甲状腺平均炎症得分为2.29,经ELISA法测得模型组TG-Ab显著高于对照组(P＜0.01),但血清T4和TSH两组之间无显著性差异(P＞0.05)。李叙颖等[21]将雌性SD大鼠适应性喂养1周,随机分为对照组和模型组。对照组给予蒸馏水,模型组给予0.64g/L的高浓度碘化钠碘水。在第4周的第1天和第4天,于造模组大鼠后足皮下多点注射0.2mL初次免疫乳化剂(含100μg mTg);第5～8周后在大鼠四肢内侧及背部皮下多点注射0.2mL加强免疫乳化剂(含100μg mTg),每周1次;对照组每次注射同等剂量蒸馏水。结果显示,与对照组相比模型组TG-Ab、抗甲状腺过氧化物酶抗体(antithyroid peroxidase antibody,TPO-Ab)水平显著升高(P＜0.01),血清T3、T4水平降低,TSH水平升高(P＜0.05)。Duan等[22]选取Wistar大鼠进行造模,大鼠在第1天腹腔注射猪甲状腺免疫球蛋白(porcine thyroglobulin,pTg)进行初次免疫(150μg pTg溶于75μL生理盐水中,并用等量的CFA进行乳化)。在第7天和第21天,大鼠进行注射pTg加强免疫(150μg pTg溶于75μL生理盐水中,然后用等体积IFA乳化)。与生理盐水组相比,模型组TG-Ab水平均显著升高(P＜0.05)。

3.3 脾细胞体外活化移植免疫法

Fang等[23]用150μg mTg联合15μg脂多糖(LPS)静脉注射CBA/J小鼠(每10d1次,共2次),抽取其脾细胞并在含有25μg/mL mTg和5 ng/mL IL-12的培养基中培养,供活化使用,72h后将3×107个脾细胞静脉注射至经500-rad辐射的同源小鼠中,第20天后经HE染色甲状腺组织,观测到嗜中性粒细胞广泛浸润,严重等级为(4.8±0.2),血清T4水平较正常水平偏低(2.8±0.4μg/dl＜3.0 μg/dl)。

脾细胞体外活化移植免疫法通常用来诱导肉芽肿性自身免疫性甲状腺炎(granulomatous experimental autoimmune thyroiditis,G-EAT),该方法与外源性甲状腺抗原免疫法相比甲状腺淋巴细胞浸润程度更为严重,易发生肉芽肿病变,且该种炎症通常在第60天消退或进展为纤维化,这取决于第20天甲状腺损伤的程度[23]。

3.4 核酸免疫法(nucleic acid(cDNA)immunization,cDNA免疫法)

核酸免疫法指克隆出人甲状腺球蛋白(human thyroglobulin,hTg)的全长cDNA,再与腺相关病毒载体整合,将该腺病毒(5.0×109个)溶于50μL的磷酸缓冲溶液(含10%甘油),注入小鼠的胫骨肌肉中。该种方法能使骨骼肌肉细胞大量摄取质粒cDNA并将其蛋白产物表达在细胞表面[24]。Faustino等[25]选择雌性CBA-J小鼠作为核酸免疫的实验动物进行研究:模型组小鼠被表达hTg的腺病毒免疫(Ad-TG),阴性对照组被表达lac-Z的腺病毒免疫(Ad-LacZ),阳性对照组采取外源性甲状腺抗原免疫法,分别于第1天初次免疫和第21天加强免疫。结果表明,所有模型组小鼠hTG抗体均为阳性,与阴性对照组相比,实验组小鼠血清hTg、mTg、mTPO抗体水平显著提高(P＜0.001),但较阳性组抗体水平低。Jacobson等[26]在cDNA免疫前将布比卡因注射到雌性C3H/Hen小鼠右侧股四头肌中,因肌毒剂被证实能够提高靶基因的表达[27],分为2组进行实验:对照组采用肌肉静脉注射含hTg的cDNA,模型组采用电穿孔法注射含hTg的cDNA,用ELISA法检测TG-Ab水平,发现与直接注射相比,电穿孔递送cDNA显著增加了再生肌肉中TG-Ab的水平(P＜0.05)。

cDNA免疫法是一种建立HT动物模型的崭新途径,在开始产生免疫反应之前,以正确的构象将hTg呈递给了T细胞,且无需佐剂的参与,更接近地模拟出人类自身免疫性甲状腺炎的发生发展,除此外该种方法使得修改hTg cDNA的基因序列成为可能,这将为今后研究不同hTg序列变异对机体的影响提供重要实验基础。除肌肉直接递送核酸外,最新的超声递送系统不仅具有更高的安全性和有效性,同时将实验侵袭性降到了最低,对实验动物的伤害大大减少[28]。

4 甲状腺癌模型的建立

根据肿瘤起源及分化差异,甲状腺癌按病理类型主要分为:乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、滤泡样甲状腺癌(follicular thyroid carcinoma,FTC)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)、低分化癌以及间未分化性甲状腺癌(anaplastic thyroid cancer,ATC)等。大数据显示,在这些亚型中PTC是最常见的,约占所有甲状腺癌80%,FTC约占10%～15%,ATC约占5%,其余少数为MTC[29],其中ATC较分化良好的甲状腺癌转移程度更为严重,高达70%的ATC患者会发生全身转移,肺是癌症转移中最常见的部位,占比高达80%[30]。

4.1 诱发性肿瘤模型

诱发性肿瘤模型指采用化学、生物、物理等致癌手段,如用化学致癌剂、放射线、生物毒素等方法诱发实验动物产生致癌物,造成动物组织、器官或全身性的损伤,产生功能及代谢改变等异常状况。Zheng等[31]将50只雄性SD大鼠随机分为3组,对第2、3组的动物分别给予致癌物,对照组(第1组)则在饮用水中添加赋形剂。第2组SD大鼠于腹膜内注射二乙基亚硝胺(DEN)(按重量计100mg/kg,溶解于生理盐水溶液中),第3组SD大鼠分别在在第5、8、11和14天腹膜内注射4次甲基亚硝脲(MNU)(按重量计20mg/kg,溶解于柠檬酸盐缓冲液中,溶液pH6.0),实验结果显示,所有模型组血清TG-Ab水平明显高于对照组(P＜0.05),所有模型组的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)水平明显高于对照组(P＜0.05)。Dalke等[32]将F1小鼠暴露于I131中,发现受辐射照射的小鼠甲状腺癌变的概率明显高于未受辐射的对照组,大部分辐射小鼠的甲状腺存在单纯增生和复杂增生,较少部分发展为FTC。

诱发性肿瘤模型能在短时间内复制出数量较多的肿瘤模型,因而经常被研究者们采纳使用,其具有操作简单,成本低廉等特点。但由于该种模型通常是采用致癌药物迅速造模,难以观测肿瘤的动态发生、发展,只能用于简单的药效考察,不利于对甲状腺癌进行细胞及分子水平的研究。

4.2 基因工程小鼠模型

医学者们利用分子生物学对甲状腺癌进行不断探究发现,大多数甲状腺癌都伴随基因突变,包含原癌基因的激活性突变、融合性表达和抑癌基因的失活性突变或缺失。Pozdeyev等[33]对779例甲状腺癌患者进行了基因分析,发现74%的PTC患者BRAF基因发生了突变(特别是V600E和BRAF融合表达),42例(9%)发生了RAS基因突变,34例(7%)发生了RET基因突变,10%的患者发生了抑癌基因TP53缺失,而大多数FTC患者则是发生了RAS基因突变(43/65例,66%),其中14%发生了PTEN基因缺失,12%发生了TP53和RBM10基因缺失,未分化甲状腺癌两个最常见的突变基因是TP53和TERT(均为65%)。

Knauf等[34]将Tg-BRAFV600E系(Tg-BRAF2和Tg-BRAF3)表达于转基因FVB/N小鼠,让携带该基因的片段注入受精的FVB/N小鼠卵中,使之假孕,通过qRT-PCR法和Southern blot印迹杂交法确认胚胎小鼠已整合该转基因,最后将该胚胎小鼠与野生型FVB/N小鼠杂交,从中稳定产生BRAFV600E突变株系。实验结果表明Tg-BRAF2和Tg-BRAF3小鼠的甲状腺组织中均存在BRAFV600EmRNA,尤其是在Tg-BRAF2小鼠中最为明显。5周后,Tg-BRAF2小鼠的TSH水平显著升高,雄性小鼠平均比对照组高出80倍,而Tg-BRAF3小鼠TSH水平较正常组增加2倍,血清T3水平有所下降但无统计学意义(P＞0.05)。对Tg-BRAF2小鼠的甲状腺进行组织学检测,发现肿瘤累积甲状腺腺体两叶呈多灶性,肿瘤细胞显示出人类乳头状癌的核特征,其中Tg-BRAF2、Tg-BRAF3发展成PTC的概率分别为93%和35%。McFadden等[35]将TPOCreER小鼠与含有Cre诱导的等位基因BRAFV600E、BRAFCA的同源小鼠杂交,后给予他莫昔芬数周(简称TB组),组织学检测表明其甲状腺肿瘤具有TPC相似的乳头状形态和核特征,免疫组织化学显示细胞外调节蛋白激酶磷酸化表达增加。将Trp53等位基因与TB组杂交形成TBP三转基因小鼠后,表现出更为严重的TPC(癌细胞体积变大,局灶性坏死增多),另有50%转变为ATC,其中5/26只动物发生了肺转移(19%),说明TP53基因的缺失会增加PTC到ATC转变的概率。

甲状腺癌基因工程小鼠模型使人类对甲状腺疾病的研究已深入到细胞及分子水平,可以直接按照研究目的设计和培育所需的小鼠,这无疑是构建了人类对甲状腺癌原癌基因、抑癌基因、机制靶点等研究的桥梁,为发病机制、药物筛选和临床医药研究提供了宝贵的实验基础。但基因调控机制往往十分复杂,目前基因工程小鼠模型提供的信息还很局限,转基因小鼠的出现是否会导致新的癌基因产生,有待进一步研究。

4.3 异种移植甲状腺癌模型

异种移植甲状腺癌模型是指将人甲状腺瘤细胞皮下注射(异位移植)或甲状腺内注射(原位移植)到免疫缺陷小鼠中。张乐乐[36]对雌性BALB/c裸鼠右后肢腹侧皮下注射TPC-1和SW579细胞悬液,发现接种SW579细胞的小鼠均未成瘤,接种TPC-1细胞裸鼠瘤体体积在第5天后达到了500 mm2,经HE染色并在高倍镜观察肿瘤细胞,可以看到细胞核形状不规则且染色加深,并可见紊乱的核分裂象。Kim等[37]静脉注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉小鼠,将5μL未分化甲状腺癌细胞株(ARO、DRO、和C643细胞系)悬浮液注射到8～12周大的雄性athymic裸鼠的甲状腺或者侧腹中,适应性喂养两周后,用CO2吸入处死老鼠,并解剖检查肿瘤。发现所有裸鼠甲状腺中有明显的肿瘤细胞浸润,3种细胞系均有100%的致瘤性,其中注射DRO细胞系的裸鼠肺转移率很高,当癌细胞接种数量为2.5×104个/只时,肺转移率最高,为80%。另测得原位甲状腺肿瘤微血管密度明显高于异位甲状腺肿瘤(P＜0.05),原位肿瘤中促血管生成因子VEGF和IL-8的表达水平高于异位甲状腺肿瘤(P＜0.05)。

异种移植甲状腺癌肿瘤模型造模迅速,移植瘤模型个体差异较小、接种成活率高、重复性良好;其中原位肿瘤模型的建立较为复杂,需要的手术技术较高,但能使癌细胞直接在起源器官中生长,有较高的外显率和再现转移性。

5 小结

甲状腺疾病动物模型的建立是研究甲状腺疾病发病机制的关键方法,一个成功的动物模型不但要简便可行、重复性高,更需要准确地模拟疾病的发生、发展。在上述模型中,甲亢、甲减模型单纯停留在给药造模,提高或减少甲状腺激素合成,虽然快速高效,但它忽略了疾病复杂的发病过程如亚甲减到甲减这一过程,而cDNA免疫造模桥本甲状腺炎使修改hTg cDNA的基因序列成为可能,但该种方案技术不够成熟仍需进一步开发,甲状腺癌转基因模型的建立也为研发治疗甲状腺癌靶点药物研究提供了新思路。所以研究出一系列与疾病发展更贴切,操作更为便捷、经济,并且兼顾环境、遗传、肠道微生态、免疫等方面使其更能全面反映人类甲状腺疾病进展的动物模型是今后研究甲状腺疾病的重点之一。