脑缺血性卒中血脑屏障破坏模型建立与功能障碍的定量检测方法及进展

杨净松吕 梁宋 巍刘兴利

(云南省第一人民医院放射科,昆明 650000)

脑卒中(stroke)尤其是占大部分的脑缺血性卒中(ischemic stroke,IS)是当前威胁人类的尤其是发展中国家人民健康的首要因素[1-2],IS 主要是由突然流向大脑的局部脑血流量减少引起的,脑血性卒中后不久,代谢紊乱和能量失衡在细胞和亚细胞水平传播到继发性损伤机制中如炎症、神经胶质细胞增生和氧化应激等,继而导致神经元,神经胶质细胞和血管内皮细胞死亡。

血脑屏障(BBB)是中枢神经系统的独特而重要的特异性结构,早期认为BBB 可以调控脑组织血流供应,在控制物质交换功能上也具有重要的调节的作用[3],参与维持脑组织液中水和电解质的平衡,并且必须保护神经元免受血液中潜在有害物质的侵害[4],BBB 损伤和功能障碍是脑缺血后卒中的突出病理特征,缺血卒中后的脑细胞水肿、凋亡到坏死过程BBB 的破坏程度与发病的严重程度有着密切的关联,但既往的实验仅仅关注BBB 的破坏与否,既0 或1,对于BBB 破坏程度的量化仍是实验中的一项难题,本文将针对各种动物模型及相关BBB影像学评估手段的最近进展进行阐述及回顾。

1 与BBB 构成结构破坏的相关检测敏感标记物

BBB 内侧为血管内皮细胞以及其周围的紧密连接(tight junction,TJ)构成的,参与构成TJ 主要结构蛋白包括ZO-1、occludin 与claudin-5 等,在脑缺血卒中发生后可以通过免疫组化与蛋白质印迹实验评估连接蛋白的表达,继而反映血脑屏障的破坏情况(BBB 破坏时连接蛋白表达、分布减低)[5],实验证实,缺血2 h 后,BBB 在体外和体内均受到破坏,在体外细胞实验中, BBB 的破坏主要由caveolin1 介导的claudin-5 重新分布和MMP 介导的闭合蛋白降解导致快速内皮屏障破坏引起的氧葡萄糖剥夺[6],因此ZO-1、occludin 与claudin-5 的表达改变提示了血脑屏障破坏与重建,BBB 内皮细胞较周围毛细血管内皮细胞较为明显的特点是丰富的线粒体量,有实验发现在梗塞后30 min,约60%受缺血影响的血管显示出了内皮水肿,并伴有水肿星形细胞,证实在缺血性脑卒中发生后血管内皮水肿早于BBB 破坏[7],同时也暗示BBB 的破坏是一系列级联反应引起的,是一个动态变化的过程。

周细胞除了血脑屏障(BBB)的发育和维持,跨BBB 的白细胞运输和血管生成外,调节神经组织血流以配给相应的神经代谢也起到了重要作用[8]。周细胞对于缺血较敏感且容易受损而产生大量的过氧化酶如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、氧化酶4(NOX4)等[9-10],这种酶会在梗塞周围区域的微血管周细胞中表达上调,这有助于激活金属蛋白酶9(MMP-9)加剧BBB 分解[11],发生IS 后,血浆基质金属蛋白酶(MMP)首先升高,MMP 是一种蛋白水解酶,可以降解细胞外的大多数成分并重塑细胞外空间,其中如MMP-9 异常升高与脑卒中的加剧存在关联[12],实验证实血脑屏障的破坏与MMP-9表达增加呈明显相关[13],这些机制会加重缺血卒中后的组织损伤和脑水肿[14],因此,预防周细胞功能障碍可通过促进微循环再灌注并预防出血和水肿来改善再通疗法的疗效。 在梗塞周围组织中,周细胞与微血管分离并促进血管生成和神经发生,对中风预后产生积极影响,有研究证实血小板衍生生长因子-β(PDGFR-β)在周细胞中表达上调[15-16],其数量增加并开始从微血管壁迁移至新形成的脉管芽以促进缺血性损伤后的成熟。

2 脑缺血卒中BBB 破坏的模型建立与BBB 破坏的实验检测方法进展

2.1 体外BBB 细胞培养模型及与其局限性

体外BBB 模型的构建主要是基于原代细胞或永久脑内皮细胞系(BCE)的细胞培养模型,目前主要应用于研究BBB 的渗透性筛查、各种药物向脑内转运的模式检验与脑血管毛细血管内皮细胞物质转运机制及病理生理研究[17]。 与基于动物的IS 体内模型相比,体外模型具有多种优势:(1)研究缺氧/葡萄糖糖减低对细胞死亡的影响更为直接和容易;(2)可以在血脑屏障内的细胞水平上进行代谢研究,而不会使其他器官的其他细胞复杂化;(3)可以容易地研究培养细胞之间复杂的细胞内信号传导途径及其在疾病过程中的潜在作用[18]。

不同物种的BBB 体外模型构建采用以进行各方面的研究工作,其中小鼠或大鼠来源的脑内皮细胞培养物的优势在于其来源已充足,并且经常被用作临床前研究的首选[18],在脑缺血性卒中的BBB研究主要聚焦于氧气葡萄糖剥夺(OGD)条件下脑血管内皮细胞的病理改变与各种蛋白、水解酶、核酸等物质的表达检测及BBB 其他细胞如周细胞在缺血缺氧状态下的功能改变与保护/破坏作用机制研究[19-22],尽管大/小鼠的脑容易获得,但这些物种中内皮细胞的普遍产量较低,实验的可重复性也受到各种因素影响。 其他动物如牛、猪等动物细胞的体外模型也应用于BBB 的相关研究当中,但是鉴于不可避免的物种差异,一种可靠的人源性体外BBB模型将对高通量筛选以识别脑穿透分子或研究BBB 的发育,调节和疾病途径显然具有更高的实验价值。

采用完全分化的表型的人脑内皮细胞的原代培养对于药物开发和临床前研究是一种理想的建模工具[23],但新鲜的人脑组织很难保证持续的获取。 人类干细胞模型目前正在完善[24],有学者通过模拟类似于胚胎脑体外的微环境使得人多功能干细胞(hPSC)成功向脑内皮细胞分化[25],所得的内皮细胞具有许多BBB 属性,包括组织良好的紧密连接,营养转运蛋白的适当表达和极化的外转运蛋白活性,成功检测到葡萄糖转运蛋白GLUT-1、连接蛋白occludin-5、claudin-5 以及p-糖蛋白在内皮细胞中共表达[26],如果证明这种体外建模方法易于处理并具有良好的可重复性,将为该领域的研究人员提供巨大的机会。

虽然体外的细胞培养技术逐渐进步,体外的BBB 结构及功能也越来越接近实验动物(人)体内,但BBB 是一个复杂的结构,其病理生理改变有多重复杂的细胞间相互作用,且研究过程中关注的仅仅是与BBB 功能有紧密关系的相关蛋白,并没有将体外的BBB 结构作为一个有机动态的整体进行研究。新鲜的原代细胞获取一直是限制体外BBB 研究的瓶颈,已经有将星形细胞及周细胞与内皮细胞共同培养以模拟体内环境以提高内皮细胞相关功能高表达的方法[27],但始终无法达到内环境的复杂调节,有学者通过评估永生化的hCMEC/D3 和原代hpBEC 细胞系的总体基因表达谱,发现脑微血管内皮细胞(BEC)中重要的功能相关基因的表达出现了明显的减低[28],证明BEC 中高表达并被描述转录BBB 功能的特异性蛋白的相关基因表达受到分离培养细胞的影响,这可能与天然内环境的剥夺密切相关,故体外研究在相关的病理生理研究中仍然有较明显的局限性。

2.2 脑缺血卒中动物模型建立与BBB 的破坏检测

多种动物(小鼠、大鼠、兔、犬、山羊、猪、灵长动物)等用于脑卒中后BBB 功能观察及脑缺血在再灌注的神经病理生理及显微解剖相关的研究。 在各类文献中,占大多数的是鼠(约80%),这是因为鼠(小鼠/大鼠)的缺血性脑卒中模型的建立具有简单方便、具有较高的可重复性与成功率。 目前使用的缺血性脑卒中建模方法最常用的是MCAO(线栓法大脑中动脉局灶性脑缺血模型),闭塞时间一般为60～120 min 不等,具体实验步骤不再赘述[29-30],需要注意的是在MCAO 处理后可能由于丘脑受损而导致体温过低,故需要一定的保温措施,使其体温保持在约37℃。

目前对于脑卒中动物模型与BBB 功能的相关研究主要集中在BBB 在IS 后的动态变化,既BBB在IS 后的各个时间段的显微结构、功能与相关蛋白表达的变化研究,与之相关的各种神经保护药物的应用及药物对BBB 的功能保护机制研究等方面。对于BBB 的功能失调的定量研究主要包括染色剂的定量检测既伊文斯蓝(EB)的定量检测与异硫氰酸荧光素-右旋糖酐(FITC-Dextrans)免疫荧光检测,下面主要针对两种检测方法进行探讨。

2.3 伊文思蓝(EB)进行BBB 渗漏定量检测

EB 染料具有很强的结合血清白蛋白的能力,可作为示踪剂检测血管渗漏并定量BBB 分解,EB的定量检测是一种公认且敏感的技术,已被用于评估包括缺血性中风在内的神经疾病中的血脑屏障完整性和功能[31-33]。 该方法经济简便、高效,具有较高的可重复性,并且可以适用于任何实验室,目前广泛应用于各种相关BBB 的功能紊乱研究中[34]。 具体方法为:在MCAO 建模成功后,采用静脉注射法(鼠尾静脉/颈静脉/股静脉)缓慢注射EB 染色剂(5 min 注射完成),按照期望的时间(缺血后指定时间或再灌注指定时间等)处死,取出大脑,解剖大脑半球,锐器分离左右半球并分别称重,在磷酸盐缓冲盐水中制匀浆,然后使用涡旋仪将其与2.5 mL 三氯乙酸(60%)混合之后进行离心15 ～30 min,随后静置于并低温保存约10 min,吸取上清液,使用分光光度计在610 nm 处估计EB吸收[33,35],根据EB 的标准曲线估计EB 渗漏的量,并将结果表示为ug/g。

EB 染色剂的定量评估主要用于以下方面:(1)BBB 相关研究如各种疾病模型的BBB 功能变化,使用EB 染色剂渗漏量衡量BBB 的破坏程度,结合金属激酶MMP 等BBB 破坏相关联的水解酶[36],继而分析BBB 破坏程度的动态变化及与相关疾病病程变化的相关性[37-38],通过BBB 结构蛋白(ZO-1、occludin-5、claudin-5)等相关功能蛋白的表达检测以了解BBB 破坏的机制[36];(2)在药物研究中用于评估某种药物(刺激因素)对疾病模型的治疗/缓解效果[38-41],将染色剂的定量分析作为评估BBB 破坏情况的客观指标,继而了解实验/对照组在进行干预后的BBB 功能差异,并对药物效果进行评估;(3)用于验证BBB 诱导破坏模型建模是否成功[42]。

虽然EB 定量检测法简单易行,但是EB 染色在检测过程中需要进行血管内的冲洗灌注然后再进行脑实质内的染料提取,这一过程中可能造成脑内小血管再破裂导致脑实质内染色剂增多[43-45],且操作的人员个体及技术差异可能导致结果的差异,对于定量检测来说其客观性会受到质疑。 分光光度计测量的EB 染料浓度,在大体上无法进行EB 染色区域的定量(BBB 破坏范围),Reeson 等[46]在研究抑制VEGF 信号转导对脑卒中的保护作用中应用免疫荧光图像定量分析的方法,将梗死区域内荧光体积减去血管官腔内荧光面积,之后将周围皮层的染料荧光面积减小鼠相对应深度的对侧染料荧光以量化EB 的渗漏,在将来的研究当中值得进一步应用。

2.4 异硫氰酸荧光素-标记物荧光(FITC-)进行定量检测

使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记不同分子量的物质(白蛋白、高/低分子量右旋糖酐、葡萄糖等),尤其是FITC-Dextrans 是用于检测BBB 渗漏常用试剂[44,47-49],该物质具有不同的分子量,一般为了使BBB 渗漏实验效果明显,常选用分子量相对小的试剂用以标记BBB 渗漏的感兴趣区[50-51],高分子量(2000×103)的FITC-Dextrans 可以很好地吸附于血管壁内,继而作为标记血管管腔的高亮荧光标志而被识别,且在BBB 出现明显破坏渗漏时,大分子FITC-Dextrans 也可以在管腔外被识别,故也可以用于BBB 渗漏的定量研究中,Chen 等[52]在使用大鼠进行脑缺血卒中BBB 破坏对周围脑组织研究中通过半自动测量FITC-Dextrans 标记的荧光总面积,再根据高亮区域(既血管管腔内的FITC-Dextrans 富集)调整亮度阈值,计算血管面积,继而计算出渗漏的荧光面积值,证明了BBB 破坏程度(高分子FITCDextrans 周围渗漏面积)与脑组织损伤的体积密切相关;Michalski 等[47]利用高分辨率扫描仪结合图像后处理工具对FITC-白蛋白(70×103)的连续切片进行荧光面积计算,并逐层累计(×层厚)最后得出BBB 渗漏组织的体积;Jin 等[53]将大鼠前囟作为基点作冠状切片,将前囟至后方2 mm 的切片作为观察切片,使用图像处理软件进行多层面荧光定量检测(显微镜下FITC-Dextrans 亮度最高、面积最大)荧光面积总和,并得到平均渗漏面积作为定量指标继而验证不同分子大小的FITC-Dextrans 在大鼠IS 不同时间点的渗漏,继而反映BBB 在IS 后的动态变化与相关机制;Bankstahl 等[51]在其进行大鼠癫痫发病后BBB 功能变化研究时应用半定量分析法(每只动物分析了4 个冠状脑切片,根据FITC-白蛋白的细胞外分布进行评分,无=0 分,靠近血管的极小的细胞外分布=1 分;局灶性的细胞外聚集=2 分;大量的弥散分布的聚集=3 分,计算平均值)进行BBB 渗漏情况的评价以了解BBB 在癫痫发作后的动态改变;上述实验由于重复性及样本量等因素影响,目前尚未形成一种公认的、标准的定量评估方法。

Xu 等[48]利用EB 的荧光染色与大分子量(2000×103)FITC-Dextrans 免疫荧光染色特性,由于大分子FITC-Dextrans 会聚集在血管管腔内,故可以利用这一特性计算FITC-Dextrans 覆盖面积以估算血管面积,使用显微图像处理软件对切片进行分析并得到EB 荧光染色的集合光密度(integrated optical density,IOD)与FITC-dextrans 渗漏面积,计算两者的比值(IOD/AreaFITC-Dextran),这种做法可以降低血管荧光对于BBB 渗漏量化的影响,但是这种方法目前仅应用于诱导的BBB 渗漏,并未用于IS 引起的BBB 渗漏中,根据既往研究,当IS 发生后发生BBB 渗漏严重程度更重,故血管内外均可见FITCDextrans 分布,如果可以结合Chen 等[52]的研究策略,分析EB 荧光的IOD 值与FITC-Dextrans 荧光的面积渗漏面积(总面积-血管面积)的关系以发现更好的BBB 渗漏评估手段,值得进一步探讨。

3 影像学方法对于血脑屏障破坏的相关检测技术进展

在正常生理条件下,CT 增强检查中所应用到的对比剂如碘对比剂与MRI 增强所用到的对比剂如钆类对比剂均为大分子物质,无法通过功能正常的BBB 进入脑组织质微环境内,故在正常增强造影时脑实质不会强化,如果BBB 功能发生破坏,则会发生对比剂通过BBB 进入脑实质,使得脑实质异常强化,故对于BBB 的破坏评估实际上是对原本不能通过BBB 的物质(对比剂)进行量化以反映BBB 破坏程度。

已经有研究通过检测脑实质中大分子对比剂量来反映相关疾病如脑退行性疾病等对于血脑屏障功能的影响,如应用Patlak 模型的CT 灌注成像中的渗透系数-渗透性-表面积乘积(permeabilitysurface area product, PS)[54],使用这种参数来反映肿瘤、脑缺血卒中等病变对于BBB 破坏的检测,也有应用这种模型进行动态增强技核磁共振(dynamic contrast enhanced MRI, DCE-MRI),产生类似的参数如容积转移常数Ktrans(transfer constant),目前这种技术主要在中枢神经系统疾病主要应用,进行脑内小血管渗透性定量评估和脑小血管疾病器质性评价[55],但是以上技术方法都是基于数学模型的模拟计算,对于脑组织内真实的对比剂渗漏情况无法切实反映。

目前已经有对于脑实质内对比剂定量分析的技术,主要为CT 双能量碘分析技术与磁共振检查的高强度急性再灌注标记物(HARM)检测技术。 对于碘对比剂,双源双能量CT 于图像重建后在图像空间域使用三物质解析算法,应用碘图可对特定区域组织内的碘含量进行定量,目前双能量扫描可以将水平在0.3 ～0.5 mg/mL 的极低量碘进行精确的定量评估[56]; 高强度急性再灌注标记物(hyperintense acute reperfusion marker,HARM),被定义为急性卒中患者对比后FLAIR 图像上蛛网膜下腔或蛛网膜下腔的延迟增强,并被认为与BBB 的通透性变化有关,已经有文献对于脑梗死后对比剂的外渗与出血的HARM 改变与CT 进行对照及脑短暂性缺血后的在今后的研究领域中[57-58],HARM 与双能量CT 在对比剂外渗的相关性与脑缺血卒中的研究潜力。

4 总结与展望

综前文所述,对于脑缺血性卒中后BBB 的相关研究目前主要在脑缺血后的BBB 功能变化与相关机制,各种干预因素(药物)在脑缺血后对BBB 功能的保护机制与疗效评估,根据新近文献对卒中后后BBB 破坏的探讨,随着无创检查技术的进步(MRI、CT 功能成像),虽然相关技术已经有报道,但目前尚无相关实验发现明确的与BBB 实验定量相关性或衡量手段,如果可以在无创检查与活体BBB 破坏之间寻找到相关的实验数据可以支撑其高相关性,使得BBB 的破坏检测可以通过影像学检测发现,继而应用于高级动物模型中,在今后的BBB 相关实验中将是飞跃性的进展。