灯心草煅炭前后UPLC指纹图谱研究及菲类成分含量测定△

赵梦辉，鞠成国，2*，王巍，孟则敬，贾天柱，2

1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；

2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600

灯心草为灯心草科植物灯心草Juncus effususL.的干燥茎髓，具有清心火、利小便的作用，用于心烦失眠、尿少涩痛、口舌生疮[1]，煅炭后具有止血作用[2]。现代药理研究表明，灯心草具有抗炎、抗氧化、降血压、抗焦虑、镇静等作用[3-7]。灯心草提取物中发现多种菲类化合物，以9,10-二氢菲及二聚体菲类化合物为主。菲类成分具有联苯骨架结构，被认为是植物灯心草的分类特征成分[4]，其中以去氢厄弗酚、厄弗酚、灯心草酚3 个成分含量最高[8]。中药普遍存在道地性，不同产地的灯心草质量各异。色谱指纹图谱技术从中药整体入手，以色谱特征峰构成该药材特有的色谱指纹图谱全貌，可为药材质量分析与控制提供参考[8]。

1 材料

1.1 仪器

H-Class 型超高效液相色谱仪（包括QSM 型四元高压梯度泵、FTN 型样品管理器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower 2数据处理工作站，Waters公司）；AE240 型十万分之一电子分析天平（Mettler-Toledo 公司）；FA1004B 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；Milli-Q Integral 型纯水仪（Millipore 公司）；KQ-250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DFT-100 型高速万能粉碎机（浙江温岭市林大机械有限公司）。

1.2 试药

对照品去氢厄弗酚（批号：MB13634）、厄弗酚（批号：MB13633）、灯心草酚（批号：MB13637）均购自大连美仑生物技术有限公司，纯度均大于98%；甲醇为色谱纯；无水乙醇为分析纯；水为超纯水。

10 批灯心草经辽宁中医药大学中药鉴定室王添敏教授鉴定为灯心草科植物灯心草Juncus effususL.的干燥茎髓。生品样品编号为S1～S10，炭品样品编号为T1～T10，样品信息见表1。灯心炭的制备：按本课题组前期优选的最佳工艺（控制投药质量与容器容积比为3 g·L-1，250 ℃密闭煅制15 min，待冷后取出）制得。

表1 灯心草样品信息

2 方法与结果

2.1 灯心草炮制前后指纹图谱

2.1.1 色谱条件 ACQUITY UHPLC HSS-T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～5 min，3%～30%A；5～6 min，30%～35%A；6～7 min，35%～40%A；7～20 min，40%～100%A）；柱温为27 ℃；检测波长为265 nm；流速为0.2 mL·min-1；样品室温度为10 ℃；分析时间为20 min；进样量为1.0 μL，理论板数按灯心草酚计算应不低于3000[9]。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取去氢厄弗酚、厄弗酚、灯心草酚对照品，加甲醇完全溶解，制得质量浓度分别为68.35、81.60、82.41 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 取灯心草粉末（过四号筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声（250 W，40 kHz）处理30 min，取出，放冷，再次称定质量，以95%乙醇补足减失质量，摇匀，定量滤纸滤过，取续滤液，用0.22 μm微滤膜滤至进样小瓶，即得。

2.1.4 精密度试验 取供试品（S10、T10）溶液，按照2.1.1项下的色谱条件测定，连续进样6次，测定生品各个共有峰相对保留时间的RSD 为0.02%～0.83%，测定炭品各个共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.67%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取供试品（S10、T10）溶液，按照2.1.1 项下的色谱条件测定，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，测定生品各个共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.20%，测定炭品各个共有峰相对保留时间的RSD为0.03%～0.18%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取供试品（S10、T10）粉末0.3 g，各6 份，精密称定，按2.1.3 项下方法制成供试品溶液，按照2.1.1 项下的色谱条件测定，分别进样，以灯心草酚为参照峰，测定生品各个共有峰相对保留时间的RSD为0.07%～0.41%，各共有峰相对峰面积的RSD为1.89%～2.86%；测定炭品各个共有峰相对保留时间的RSD为0.03%～0.58%，各共有峰的相对峰面积的RSD为0.87%～1.92%，表明方法重复性良好。

2.1.7 灯心草、灯心炭指纹图谱的建立 取10 批灯心草和灯心炭样品，按2.1.3 项下的方法制成供试品溶液，按照2.1.1 项下的色谱条件测定。使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）分别建立10 批灯心草和灯心炭样品指纹图谱，并生成指纹图谱的对照图谱（图1～3）[10]。根据“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）的谱峰匹配数据，10批生品色谱图中可标定15个共有峰，炭品色谱图中可标定16个共有峰。

图1 灯心草、灯心炭UPLC指纹图谱

灯心炭与灯心草相比，新增8 个峰（图3 中峰3～5、7、9、12～14）；缺失5 个峰（图2 中峰9～11、14、15），其中峰11 为厄弗酚；一些成分的量发生了明显的变化，如图2中峰12、13的含量显著降低，分别为去氢厄弗酚、灯心草酚。这说明灯心草在炮制后，化学成分的种类及含量发生了明显的变化。

图2 灯心草UPLC指纹图谱对照图谱

图3 灯心炭UPLC指纹图谱对照图谱

2.1.8 指纹图谱相似度评价 使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版），采用平均数法计算10 批灯心草和灯心炭样品的相似度[11]。结果灯心草（S1～S10）与对照图谱的相似度分别为0.995、0.999、0.995、0.999、0.999、0.999、0.999、0.998、0.996、0.999。灯心炭（T1～T10）与对照图谱的相似度分别为0.905、0.924、0.894、0.975、0.967、0.965、0.970、0.938、0.899、0.904。样品与对照指纹图谱的相似度均大于0.89，说明不同产地灯心草饮片质量一致性良好且煅炭工艺稳定，炮制后饮片质量仍具有一致性（表2～3）。

表2 10批灯心草样品与对照指纹图谱的相似度

表3 10批灯心炭样品与对照指纹图谱的相似度

2.1.9 主成分分析（PCA）将灯心草与灯心炭指纹图谱的共有峰峰面积的数据导入SPSS 26.0 软件，因子分析检验结果显示，KMO 检验系数为0.565，Bartlett 球形检验近似卡方值为278.574（P＜0.001），适合做因子分析；采用降维-因子分析技术，以特征值＞1 为提取原则[12]，共提取到4 个主因子，累积方差贡献率为95.256%，说明前4 个因子能够揭示灯心草在炮制过程中大多数的变异信息，可以反映样品主要特征，具有良好的代表性，结果见表4。采用Origin 2019 软件PCA 对10 批灯心草、灯心炭样品共有峰峰面积进行PCA，以观察炮制前后灯心草的差异，结果见图4。由图4 可知，灯心草和灯心炭的主成分空间分布有各自特定的区域，表明两者化学成分存在差异，PCA 能够将灯心草和灯心炭区分开。

图4 10批灯心草、灯心炭样品PCA得分

表4 10批灯心草、灯心炭样品因子分析特征值及方差贡献率结果

2.1.10 聚类分析（CA）运用SPSS 26.0 软件，以灯心草与灯心炭指纹图谱的共有峰峰面积为变量进行系统聚类，采用瓦德尔联接法，以平方欧氏距离作为样品相似度的距离公式，结果见图5。CA 将10 批灯心草样品S1～S10 聚为一类，10 批灯心炭样品T1～T10 聚为一类。由此可见，CA 既能全面反映灯心草、灯心炭UPLC 图的相似性，又能反映灯心草与灯心炭的差异。

图5 10批灯心草、灯心炭样品CA树状图

2.2 不同产地灯心草中3个菲类成分含量测定

2.2.1 色谱条件 ACQUITY UHPLC HSS-T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～3 min，55%～60%A；3～5 min，60%～75%A；5～7 min，75%～90%A；7～10 min，90%～95%A；10～11 min，95%A）；柱温为27 ℃；检测波长为270 nm；流速为0.2 mL·min-1；样品室温度为10 ℃；进样量为1.0 μL，理论板数按灯心草酚计算应不低于3000[13-14]。

2.2.2 对照品溶液制备 同2.1.2 项下方法，UPLC结果见图6。

图6 厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚混合对照品UPLC图

2.2.3 供试品溶液制备 同2.1.3 项下方法，UPLC结果见图7。

图7 灯心草饮片UPLC图

2.2.4 线性关系考察 精密量取2.1.2 项下混合对照品溶液，分别以不同体积分数的甲醇稀释，得一系列混合对照品溶液。按照2.2.1 项下的色谱条件测定，以峰面积为纵坐标（Y），以对照品的进样量为横坐标（X），计算得回归方程，见表5。

表5 灯心草3个菲类成分的线性关系考察结果

2.2.5 精密度试验 取2.1.2项下混合对照品溶液，按照2.2.1项下的色谱条件测定，连续进样6次，测定去氢厄弗酚、厄弗酚、灯心草酚对照品的峰面积RSD 分别为0.02%、0.01%、0.02%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取2.1.3 项下供试品溶液（S10），按照2.2.1项下的色谱条件测定，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，测定去氢厄弗酚、厄弗酚、灯心草酚峰面积RSD 分别为0.05%、0.08%、0.03%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取供试品（S10）粉末0.3 g，共6份，精密称定，按2.1.3项下的方法制成供试品溶液，按照2.2.1 项下的色谱条件测定，分别进样，测定去氢厄弗酚、厄弗酚、灯心草酚含量的RSD分别为0.08%、0.03%、0.09%，表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取供试品（S10）粉末，精密称定，分别加入一定量的对照品粉末，按2.1.3 项下的方法制成供试品溶液，按2.2.1 项下的色谱条件测定，计算回收率。结果去氢厄弗酚的平均回收率为98.67%，RSD 为0.83%，厄弗酚的平均回收率为98.95%，RSD 为0.42%，灯心草酚的平均回收率为98.74%，RSD 为0.90%，回收率均为95%～105%。

2.2.9 10批次灯心草中3个菲类成分含量测定 取不同产地的10 批灯心草饮片（S1～S10），按2.1.3项下方法制成供试品溶液，按2.1.1 项下的色谱条件测定，根据线性回归方程计算含量及3 个菲类成分的总含量[15]，并对结果降序排列，结果见表6。

表6 不同产地的灯心草3个菲类成分质量分数

3 讨论与结论

中药指纹图谱技术作为一种质量检测手段，可有效反映色谱峰信息量较大的中药质量。本研究通过建立灯心草与灯心炭对照指纹图谱，各批次的灯心草指纹图谱与对照指纹图谱之间的相似度均大于0.89，初步判断，市售灯心草质量无明显差异。药材中化学成分种类基本一致，但含量有所不同，可能与药材道地性有关；不同产地的气候、土壤、温度不同；此外采集与净制条件的差别都有可能对药材质量产生影响。灯心炭（T1～T10）与对照图谱的相似度较高，则说明灯心炭煅制工艺稳定，与灯心草（S1～S10）相似度相比均存在不同程度下降，差值依次分别为0.090、0.075、0.101、0.024、0.032、0.034、0.029、0.060、0.097、0.095，说明在煅炭过程中化学成分发生量变，且与生品饮片原产地有关。

本研究建立的CA、PCA方法均能够很好地将灯心草与灯心炭样品区分开来。CA结果表明，灯心草生品和炭品各自聚为一类，说明灯心草和灯心炭在化学成分含量上差异较大，可初步证实炮制对化学成分的影响，PCA 筛选得到影响样品分类的4 个主因子，能够揭示灯心草在炮制过程中大多数的变异信息，灯心草和灯心炭的主成分空间分布有各自特定的区域，CA 和PCA 都可将炮制前后样品进行区分，表明灯心草与灯心炭存在差异。

指纹图谱比较发现，灯心炭与灯心草相比，新增8 个峰，缺失5 个峰，其中峰11 为厄弗酚。一些成分的量发生了明显的变化，如图2 中峰12、峰13的含量显著降低，分别为去氢厄弗酚、灯心草酚，推测可能是在高温煅制过程中，分子内的酚羟基进攻分子内或分子间苄位的碳碳双键，发生加成反应，导致成分含量降低，目前不能确定新增峰所对应的具体成分，推测新增成分可能为含量降低的成分在高温缺氧条件下反应所得产物。

目前，对中药灯心草的指纹图谱研究中，多以灯心草为研究对象，暂没有对灯心炭指纹图谱的研究。本研究建立的灯心草及灯心炭UPLC 指纹图谱，能真实反映灯心草饮片炮制前后差异，相对于目前灯心草HPLC 指纹图谱研究更加高效、快速、灵敏，可为灯心草炮制前后化学成分比较及其临床使用及资源开发提供参考。

煅制得到的灯心炭经UPLC 检测，3个菲类成分含量过少，在标准曲线定量限外无法积分，故未标注灯心炭中3 个菲类成分含量。本课题组将会在后续研究中寻找生品与炭品所共有、均能用同种方法检测到、能够区分生品与炭品、能够指导药材质量判别的成分或其他指标。