基于传统煎药工艺的大枣饮片标准汤剂制备及其质量评价方法分析△

曾杉，陈锦霞，林碧珊，陈伟彦，张汝莹

国药集团 广东环球制药有限公司，广东 佛山 528305

大枣Ziziphus jujubaMill.是鼠李科枣属植物枣的果实，临床上可作为营养品食用，又可入药，对人体具有补中益气的功效［1］。我国大枣的主要产地为山东、河北、山西、河南、甘肃、新疆等地区。大枣在中药复方中入药的历史十分悠久，在《伤寒论》《本草纲目》《千金翼方》等多部古籍中均有其药用记载。现代药理学研究表明，大枣在抗肿瘤、改善心脑血管循环、增强免疫力和造血功能等方面都有显著的药效作用［2-3］。大枣主要化学成分为核苷酸类及其衍生物、皂苷类、黄酮类、多糖类等，其中包括环磷腺苷（cAMP）、尿嘧啶、鸟苷、芦丁、槲皮素、葡萄糖和鼠李糖等多种成分。cAMP 是大枣的主要水溶性成分之一，在成熟果实中含量最高，作为生理生化过程反向调节的第二信使，在基因转录和蛋白质合成中发挥重要作用［4-6］。标准汤剂是中药配方颗粒生产工艺和质量的基准样品［7］。本研究参照《医疗机构中药煎药室管理规范》煎煮方式［8］，制备了15 批大枣饮片标准汤剂，考察大枣标准汤剂的出膏率、cAMP 含量及转移率、特征图谱三大指标，旨在建立大枣配方颗粒产品质量的科学控制方法。

1 材料

1.1 仪器

H-class 型高效液相色谱仪（Waters 公司）；MS105DU 型十万分之一天平、2002 型万分之一天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型数控超声清洗仪（昆山仪器仪表有限公司）；Sunergy UV 型超纯水仪（默克公司）；2 L 电控温煎药壶（深圳一枚王有限公司）。

1.2 试药

对照品cAMP（批号：140709-201404，纯度：99.8%）、芦丁（批号：100080-201610，纯度：91.6%）、鸟苷（批号：111977-201501，纯度：93.6%）均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

大枣样品分别从河南、山东、山西、甘肃、河北等主产地购得，经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为鼠李科植物枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实，按《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版标准检验全部合格，参考《中国药典》2020 年版大枣项下炮制方法制成饮片，除去杂质，洗净，晒干，破开2～4 瓣。样品信息见表1。

表1 大枣样品信息

2 方法与结果

2.1 大枣标准汤剂的出膏率测定

取大枣饮片100 g，置于2 L 电控温煎药壶中，加水煎煮2 次。第1 次加入水800 g，浸泡30 min，文火煎煮60 min，煎液经350 目滤布趁热滤过，挤压滤布至无明显滤液渗出。第2 次加入水600 g，文火煎煮55 min，煎液用350目趁热滤过，合并2次滤液后冷却，将合并后的滤液减压浓缩至约200 g浸膏，在磁力搅拌下，浸膏加水稀释至固体质量分数约为15%，再分装至10 mL棕色西林瓶中，每瓶分装体积为5 mL，半加塞，置于真空冷冻干燥机中冻干，得大枣标准汤剂冻干粉，称质量，按公式（1）计算出膏率。

2.2 大枣标准汤剂cAMP的含量测定

本研究参考了《美国草药典》2021 年版［9］中收载的大枣果实标准中cAMP 含量测定色谱条件和供试品溶液制备方法，并进行了专属性、线性、精密度、稳定性、重复性、回收率等方法学考察，证明了该方法能准确用于测定大枣标准汤剂cAMP 的含量。

2.2.1 色谱条件 Eclipse C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μ m）；以甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾（8∶92）为流动相；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1，进样量10 µL。

2.2.2 对照品溶液的制备 取cAMP对照品约10 mg，精密称定，置200 mL 量瓶中，加40%甲醇至刻度，摇匀，制成cAMP 质量浓度为50 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取大枣标准汤剂样品约0.2 g，精密称定，置20 mL 具塞量瓶中，加入40%甲醇适量，超声处理（500 W，40 kHz）30 min，用40%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.4 专属性考察 取大枣标准汤剂供试品溶液（编号：S10）、对照品溶液和空白溶剂同时进样测定，结果见图1，表明cAMP色谱峰专属性好，不受空白溶剂干扰。

图1 大枣标准汤剂专属性考察色谱图

2.2.5 线性关系考察 分别精密吸取配制成1.073、5.365、10.730、21.460、42.920、85.840 μg·mL-1的cAMP 对照品溶液各1 µL 进行测定，以峰面积为纵坐标（Y）峰面积，cAMP 质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，线性回归方程：Y=0.704 6X-0.040 7（r=1.000 0），表明质 量浓度 为1.073～85.840 μg·mL-1时cAMP与峰面积线性关系良好。

2.2.6 精密度试验 取同一批大枣标准汤剂供试品溶液（编号：S10），连续进样6次，按2.2.1项下色谱条件测定，结果cAMP峰面积RSD为0.4%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一批大枣标准汤剂供试品溶液（编号：S10），分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定cAMP峰面积RSD为0.3%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批大枣标准汤剂供试品溶液（编号：S10），按2.2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件测定，测定cAMP含量RSD为0.8%，表明重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取同一批大枣标准汤剂供试品溶液（编号：S10）约0.2 g，精密称定，平行称取6 份，分别按1∶1 加入cAMP 对照品后，按2.2.3项下方法平行制备供试品溶液，测定cAMP含量并计算加样回收率，结果见表2。cAMP 平均加样回收率为99.7%，RSD 为0.4%，表明该方法回收率良好。

表2 大枣标准汤剂cAMP加样回收率试验结果

2.3 大枣标准汤剂特征图谱方法测定

2.3.1 特征图谱方法的建立 本研究参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》［10］，采用超高效液相色谱法（UPLC）建立了大枣标准汤剂的特征图谱方法，并对检测波长进行了考察，结果见图2。

结果表明，通过对大枣标准汤剂进行二极管阵列检测器全波长扫描，分别比较了210、230、254、300 nm 4 个检测波长下的色谱图，发现254 nm 作为检测波长时，基线平稳且干扰较小，可以检测到更多色谱峰且分离度较好，因此，综合考虑选254 nm 作为检测波长。另外通过对比考察甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸和乙腈-0.1%磷酸水溶液3 种不同流动相，发现乙腈-0.1%磷酸水溶液的峰个数、峰形和分离效果更好，综合考虑选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为特征图谱流动相。同时比较了水、50%甲醇、甲醇3 种不同提取溶剂的差异。选择提取溶剂为水时，提取峰个数最多，峰分离效果最优，最终确定特征图谱的色谱条件和供试品制备方法。

2.3.2 特征图谱色谱条件 Waters HSS T3 色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～3 min，0%B；3～12 min，0%～10%B；12～25 min，10%～20%B；25～30 min，20%～95%B）；柱温：30 ℃；流速：0.25 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：1 µL；理论板数按cAMP峰计应不低于10 000。

2.3.3 对照品溶液的制备 分别取cAMP、鸟苷、芦丁对照品适量，精密称定，加40%甲醇制成质量浓度均为50 μg·mL-1的对照品溶液，即得。

2.3.4 供试品溶液的制备 取大枣标准汤剂样品约0.4 g，精密称定，置10 mL 具塞量瓶中，加水适量，超声处理（500 W，40 kHz）30 min，用水定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.3.5 对照品指认考察 分别取大枣标准汤剂供试品溶液（编号：S7）、cAMP、鸟苷、芦丁对照品溶液同时进样测定，结果见图3，结果分别指认了峰5、峰6和峰11分别为鸟苷、cAMP和芦丁。

图3 大枣标准汤剂对照品指认色谱图

2.3.6 精密度试验 取大枣标准汤剂供试品溶液（编号：S7）连续进样6次，以峰6为S峰，各特征峰与参照峰cAMP 的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2.0%，结果见表3～4，表明仪器精密度良好。

表3 大枣标准汤剂特征图谱精密度试验的相对保留时间

表4 大枣标准汤剂特征图谱精密度试验相对峰面积

2.3.7 稳定性试验 取大枣标准汤剂供试品溶液（编号：S7），分别在0、2、4、8、12、24 h进样，以峰6为S峰，各特征峰与参照峰cAMP的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2.0%，结果见表5～6，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

表5 大枣标准汤剂特征图谱稳定性试验的相对保留时间

表6 大枣标准汤剂特征图谱稳定性试验的相对峰面积

2.3.8 重复性试验 平行制备6份供试品进样测定，以峰6为S峰，各特征峰与参照峰cAMP的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2.0%，表明方法重复性良好。

2.4 样品测定结果

2.4.1 出膏率结果 根据15批大枣饮片制成的标准汤剂平均出膏率为47.94%，按照大枣标准汤剂出膏率均值的70%～130% 计算其波动范围为33.56%～62.32%，按照大枣标准汤剂出膏率计算其波动范围为36.90%～55.73%。出膏率均值的70%～130%和波动范围相差不大。为严格控制大生产中的大枣配方颗粒的出膏率，保证大枣配方颗粒的质量均一稳定，结合15批大枣标准汤剂出膏率波动范围，取15批大枣标准汤剂出膏率均值的70%～130%，即33.56%～62.32%。15批大枣标准汤剂的出膏率为36.90%～55.73%也在此范围内，表明不同产地的大枣出膏率均一稳定。

2.4.2 转移率结果 采用《美国草药典》2021年版第三部收载的大枣果实标准［9］中cAMP含量测定方法完成了15批饮片的测定，标准中规定大枣饮片质量分数不得少于0.010%。结果显示15批大枣饮片中，cAMP质量分数为0.010%～0.044%（表7），均符合规定。采用相同方法对15批大枣标准汤剂进行含量测定，并按公式（2）计算cAMP转移率。结果显示15批大枣标准汤剂cAMP质量分数为0.013%～0.052%；cAMP 转移率为48.06%～72.86%，平均转移率为（59.82±17.95）%。为合理控制大生产中cAMP的转移率，规定cAMP转移率取均值的70%～130%较为合理，上述15批样品全在该范围内，能较为客观反映标准汤剂中的转移率特点。因此，大枣标准汤剂cAMP转移率为48.06%～72.86%。

表7 15批大枣饮片及其标准汤剂cAMP含量和出膏率、转移率

2.4.3 特征图谱结果 测定15批大枣标准汤剂的特征图谱记录色谱图，采用“中药色谱特征图谱相似度评价系统”（2012 版）进行评价，结果见图4～5，最终确定11个稳定的共有峰，11个共有峰峰面积占总峰面积比值达90%以上，符合中药注射剂指纹图谱研究的技术要求，计算15 批大枣标准汤剂的相似度均大于0.90，表明不同产地的大枣标准汤剂基础化学成分具有较好的一致性。

图4 15批大枣标准汤剂特征图谱叠加图

3 讨论

3.1 标准汤剂的制备工艺

本研究参照《医疗机构中药煎药室管理规范》［8］和《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》［11］，采用传统煎煮方法制备大枣标准汤剂，根据方剂的性能确定煎煮时间，一般药煮沸后再煎煮20～30 min，大枣属于滋补类药物需用文火慢煎约1 min。每剂药一般煎2 次，药剂第二煎的时间略缩短。由于中药饮片的质地和吸水率相差较大，应根据不同的饮片确定加水量，经考察大枣标准汤剂的加水量浸过药面2～5 cm 为宜，确定一煎加8 倍水，二煎加6 倍水。煎煮后经350 目的滤布滤过，滤液迅速用水冷却，防止成分受热损失，合并2 次煎液后采用低温减压浓缩后冻干，制得大枣标准汤剂冻干粉。本研究考察了不同目数的滤布的滤过效果，最终选择350 目滤布进行固液分离；同时采用50 ℃低温减压进行浓缩，保证标准汤剂样品的稳定。

图5 15批大枣标准汤剂对照特征图谱

3.2 标准汤剂的应用

本研究采用传统水煎煮工艺制备了15批大枣标准汤剂，结果出膏率为36.90%～55.73%，平均出膏率为（47.94±14.38）%。测定大枣标准汤剂中cAMP转移率为48.06%～72.86%，平均转移率为（59.82±17.95）%，测得的出膏率和转移率均在标准汤剂《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中规定的70%～130%，具有较高的集中度，表明大枣标准汤剂研究符合技术要求。建立的大枣标准汤剂特征图谱共确定11个特征峰，并通过对照品指认了鸟苷、cAMP和芦丁3个已知成分。将多批结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）计算相似度，结果15 批大枣标准汤剂样品的特征图谱相似度均高于0.90，表明不同产地的大枣饮片成分差异不大，质量稳定，上述结果可以作为大枣配方颗粒质量控制依据，也能为其生产工艺提供质量控制参数，从而提高产品质量。