巨细胞病毒疫苗研究进展

孙 钰， 张鲁平， 蒋银华， 秦 刚

作者单位： 1. 南通大学附属医院感染科，江苏南通 226001；*耳鼻咽喉科；

2. 南通市妇幼保健院临床医学研究中心。

1 巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）感染现状

CMV 感染是一个被忽视的重大公共卫生问题,全球近80%人口存在CMV 感染，感染与地理位置、种族和经济状况有关。在发达国家，CMV 感染率低于发展中国家，育龄期女性CMV 血清特异性抗体阳性率为41%～50%[1]，新生儿先天性CMV感染率为0.5%～1%[2]。在发展中国家，CMV 感染率较高，育龄期女性CMV 血清特异性抗体阳性率高达80%～100%，新生儿先天性CMV 感染率为0.6%～6.1%[3]。我国是CMV 感染的高发区，我国孕妇的CMV 血清特异性抗体阳性率为94%～98%，新生儿先天性CMV 感染率约0.7%[4-5]。CMV 感染也是导致异基因造血干细胞移植（HCT）和实体器官移植（SOT）患者发病率和死亡率高的重要原因之一，其中HCT 后CMV 活动性感染总发生率为44.08%，病死率为16.18%，异基因HCT后CMV 感染病死率高于同基因HCT 移植与自体移植者（P＜0.01）[6]；在没有进行抗病毒预防的情况下，SOT 患者CMV 感染率为75%，具体发病率因移植器官的类型而异[7]。

CMV 是人类疱疹病毒中最大的一种，为双链DNA 病毒。完整病毒颗粒直径为200～300 nm，电镜下由外向内分别为含有多种糖蛋白的脂质包膜、被膜、二十面体立体对称衣壳和包含其基因组的内部核蛋白核心。脂质包膜含有糖蛋白，能够诱导产生中和抗体，目前发现的CMV 包膜糖蛋白包括糖蛋白 B、糖蛋白H、糖蛋白L、糖蛋白O 等。CMV 被膜介于二十面体衣壳与包膜之间，是疱疹病毒所特有的结构，其被膜蛋白包含丰富的磷酸化蛋白pp65，能诱导强烈的细胞免疫应答，在病毒的装配、基因调控和改变宿主细胞代谢等方面发挥作用。CMV 衣壳蛋白除了构成病毒衣壳外，还有锚定病毒DNA 的作用。基因组是一个64 nm 的线性双链DNA 分子，包含超过230 个蛋白质的非重叠开放阅读框；其中一种蛋白质是DNA 聚合酶，它在病毒复制中起着不可或缺的作用，并且是目前所有批准的抗病毒药物的主要靶点[8]。CMV 感染会引起强烈的病毒特异性CD4+和CD8+T 细胞反应。针对CMV 的不同抗原，机体能够产生特异性抗体，其中IgG 表示既往感染，IgM 表示急性或近期感染。研究发现，机体抗CMV 产生的体液免疫应答主要针对病毒包膜糖蛋白gB，而细胞免疫应答主要针对被膜蛋白pp65[9]。

CMV 感染人体后主要通过体液传播，包括唾液、尿液、精液、阴道分泌物和乳汁，感染后可累及全身多个系统及脏器，持续存在于被感染宿主体内并在骨髓细胞中保持休眠状态。当宿主免疫力下降时，病毒发生再激活，被释放到血液和其他体液中，从而出现感染后症状[10]。所以不仅是未感染过CMV 的人群需要接种疫苗，针对CMV 血清抗体阳性人群接种疫苗仍是十分必要的，可以增强机体免疫反应，减轻病毒再激活后的临床症状，减少CMV 感染后并发症等。在个体成为血清抗体阳性之前的年龄进行免疫接种疫苗可以最大限度地发挥作用。如果疫苗最终部署在血清阳性比例很高的年龄人群中，在血清学测试中可能有一些效用，以确定哪些人可能从疫苗中获益最多，但如果接种血清阳性者没有安全问题，也可以考虑在没有血清学测试的情况下使用已知的仅对血清阴性者有益的疫苗。尽管在出现大量血清反应阳性的年龄接种疫苗可能是安全的，但如果在许多青春期及育龄期女性出现血清反应阳性之前的年龄就接种疫苗，可能会更有说服力[11]。

2 疫苗研究进展

CMV 疫苗被美国医学研究所和疫苗咨询委员会认为是21 世纪疫苗中的高度优先报告事项[12]。虽然目前对CMV 疫苗的需求十分迫切，但至今尚无CMV 疫苗上市。第一代CMV 疫苗主要是减毒活疫苗，有免疫原性但临床预防效果差[13]。第二代疫苗主要是亚单位疫苗，如gB 疫苗、gH/gL/UL128/UL130/UL131A 五聚体疫苗、pp65 肽疫苗。第三代疫苗为各种基因疫苗，如DNA 疫苗、病毒载体疫苗。当前的CMV 疫苗已经进行了广泛的临床研究，在针对特殊人群的CMV 感染及相关疾病预防方面取得了令人鼓舞的成绩。如果疫苗能有效预防感染或病毒脱落，最初接种CMV 疫苗的目标人群包括青春期及育龄期女性[14]。

2.1 减毒活疫苗

Towne-Toledo 嵌合体疫苗Towne 株和未减毒的Toledo 株的基因组重组研制4 种独立的嵌合候选疫苗。首次人体试验是一次Ⅰ期临床试验，试验结果表明4 种嵌合CMV Towne-Toledo 候选疫苗对20 名CMV 血清阳性受试者均具有良好的安全性与耐受性，没有与疫苗接种相关的严重不良事件。为辨别4 种不同疫苗在安全性或耐受性方面的差异,在之后进行了一项针对CMV 血清阴性受试者的Ⅰ期临床试验。36 名受试者均分为4 组，分别接受Towne-Toledo 嵌合体1～4 疫苗。试验结果表明，接种疫苗后发生抗体反应，嵌合体1～4的血清抗体由阴性转为阳性的人数占总人数的百分比不同，分别为11.11%、33.33%、0、77.78%，显然嵌合体4 在诱导血清转化方面最成功。在接种后12 周或发生血清转化者的 52 周内，所有受试者的尿液或唾液检测CMV 均为阴性，即该疫苗在CMV 血清阴性受试者中具有良好的耐受性并且不会被排出体外。检测到发生CD4+T 细胞反应的概率为2.78%，仅在1 名接受嵌合体4 的受试者中检测到。检测到发生CD8+T 细胞反应是在 11 个血清转化者中，概率为72.72%。然而，在所有血清转化的受试者中，与其他疫苗相比，发生血清学反应的强度、持续时间并没有明显更强、更长，即没有证据表明该疫苗的免疫原性强于其他疫苗。需要注意的是该疫苗尚没有在其他受试者中进行试验，无法确定在其他受试者中的安全性和免疫原性，且仍需进一步的试验确定该疫苗的最佳剂量[15]。

2.2 亚单位疫苗

2.2.1 gB 疫苗 现阶段研究最为深入的疫苗是gB亚单位疫苗。gB/MF59 疫苗为重组CMV gB 蛋白和MF59 佐剂组成的疫苗，最初由美国 Chiron 公司研发，之后授权给法国Sanofi Pasteur 公司。已在三种受试者分别为经产妇、SOT 受者及青春期女性的Ⅱ期临床试验中显示出部分保护作用。其中在针对CMV 血清特异性抗体阴性的健康经产妇和青春期女性的两项Ⅱ期临床试验中，总有效率为43%～50%[16-17]。两次试验的具体结果如下：受试者为经产妇，随机分配为疫苗组和安慰剂组。疫苗组的年感染率为3.30%，安慰剂组为6.60%，总体疫苗效力为50%[16]。受试者为青春期女性，试验结果表明，若按方案接种，疫苗有效率45%。总体而言，该疫苗安全且具有免疫原性[17]。另一项Ⅱ期临床试验是针对等待肾或肝移植的成年人，140 名受试者按照CMV 血清阴性和血清阳性1:1随机分配为疫苗组和安慰剂组。研究表明疫苗组gB 抗体滴度显著增加。在移植后出现病毒血症的患者中，gB 抗体滴度与病毒血症的持续时间呈负相关（r=0.62，P=0.002 2）。在有血清阳性供者的血清阴性受者中，接种疫苗者的病毒血症持续时间 （12%对57%，P=0.048 0）和更昔洛韦治疗天数（13% 对 69%，P=0.028 7）减少。同时，试验结果认为该疫苗诱导的抗体可能结合CMV 阳性供者所捐献器官中的病毒，防止移植后受者发生病毒血症[18]。此外，为验证该疫苗对于CMV 血清特异性抗体阳性人群的有效性，对已感染CMV 的人群进行了Ⅰ期临床试验。研究表明，在慢性 CMV 感染的女性中接种gB/MF59 疫苗后，CMV 特异性抗体和CD4+T 细胞反应均可增强[19]。评估疫苗策略的金标准传统上认为是诱导有效的中和抗体反应，有数据显示，血清阳性移植受者的血清具有中和抗体，但接种gB/MF59 后这些抗体并未明显增强。最有可能的是，gB 疫苗的有效性并不完全依赖于经典的中和生物活性，还应归因于部分非中和抗体[20]。

2.2.2 gH/gL/UL128/UL130/UL131A 五 聚 体 疫苗 V160 疫苗由是德国的Merck Sharp ＆ Dohme公司研发，该疫苗源自AD169 毒株，在疫苗制造过程中使用一种称为Shield-1 的合成化学物质作为培养基中的补充剂，能够严格调控病毒生长，使其在接种后无法在机体内正常复制。并通过基因改造恢复病毒gH /gL/UL128/UL130/UL131A 五聚体复合物的表达，该复合物为病毒感染机体所必需的决定因素，也是机体感染后自然免疫产生中和抗体的主要靶点，应答主要集中在IE1 和pp65上。在一项受试者为CMV 血清特异性抗体阳性及阴性人群的Ⅰ期临床试验中。检测疫苗组受试者的唾液或尿液，没有发现病毒脱落，证实了V160存在复制缺陷。在血清特异性抗体阴性的受试者中，接种该疫苗后受试者抗上皮细胞感染的中和抗体效价明显增加。接种疫苗后的第7 个月，所有疫苗接受者均出现中和抗体阳性，在第12 个月和第18 个月，大多数疫苗接受者中和抗体仍呈阳性。证明该疫苗对CMV 血清阴性与阳性人群的安全性和免疫原性均良好[21]。虽然V160 不能在体内复制，但仍可以有效地启动已接种疫苗的受试者的免疫系统。此外，一项Ⅱb 期多中心研究自2018 年开始进行（NCT03486834），目的是评估2 剂和3 剂V160 方案在16～35 岁健康血清阴性女性中的安全性、耐受性、有效性和免疫原性。该试验共有2 200 名参与者，参与者在第1 天、第2 个月和第6个月接受V160 疫苗（3 剂量方案）；第1 天和第6个月接受V160 疫苗，第2 个月接受安慰剂（2 剂量方案）；或在第1 天、第3 个月和第6 个月接受安慰剂（安慰剂对照组）。目前尚无研究结果公布。Towne-Toledo 疫苗和gB/MF59 疫苗在CMV 血清

阴性的妇女中，这两种疫苗对CMV 感染疗效温和，因为都缺乏病毒五聚体复合物的表达，而病毒五聚体复合物是CMV 感染上皮细胞和内皮细胞的趋向性决定因素，也是在自然感染期间观察到的有效中和抗体的关键抗原。V160 是第一个设计用来表达五聚体复合物的候选疫苗，这项首次人类评估的结果证实了在临床前评估中观察到的五聚体复合物在诱导有效中和效价对抗人类上皮细胞病毒感染方面的重要性。虽然已经证明五聚体特异性抗体在中和上皮细胞进入方面比gB 抗体强，但关于五聚体疫苗的研究结果尚不足以说明五聚体疫苗强于gB 疫苗。

2.2.3 pp65 肽疫苗 CMV PepVax 疫苗由由美国希望之城医疗中心和美国国家癌症研究所研制，由美国辉瑞公司提供佐剂，是由HLA A*0201 人群的限制性CTL 表位 pp65495-503 与破伤风毒素T 细胞表位融合而成的肽疫苗，佐剂为Toll 样受体 9 激动剂PF03512676。pp65 被膜蛋白是CMV血清反应阳性健康成年人中最常被免疫学识别的CMV 抗原之一。在一项Ⅰb 期临床试验中，共有68 名HLA-A*0201 CMV 血清阳性或血清阴性的受试者，试验结果证明尽管添加 PF03512676 佐剂会增加不良反应的反应原性，但该肽疫苗在大多数受试者中是安全且耐受的。但是，研究报告显示使用 PF03512676 佐剂时发生流感样不良反应的比例很高，这表明需要谨慎用于免疫活性供体产品的进一步开发[22]。异基因HCT 受者极易受到机会性感染，其中CMV 仍然是HCT 受者的主要感染并发症。在一项主要目的是研究该疫苗的安全性与免疫原性的Ⅰb 期临床试验中，受试者为36 名CMV 血清阳性的HCT 受者，且为HLA-A* 0201限制性，按CMV 供体血清水平分层后随机分配到疫苗组或对照组。对照组在接受HCT 后的100 d内 pp65495-503 特异性CD8+T 细胞的水平增加为基 线 的1.4 倍（95%CI：0.6～3.3，P=0.27）， 而疫苗组增加为基线的3.5 倍（95%CI：1.6～7.9，P=0.0018），疫苗效应疫苗组与对照组相比从基线到第100 天平均增加2 倍（95%CI：1.04～3.51，P=0.025）；移植后180 d 内，疫苗组与对照组相比病毒再激活减少（1 例对 6 例，P=0.039），发生病毒血症者接受抗病毒治疗后痊愈的时间缩短（15 d对 263 d，P=0.03）。研究表明该疫苗安全性、耐受性与免疫原性均良好，可以减少CMV 再激活和抗病毒药物的使用[23]。一项多中心Ⅱ期临床试验自2015 年开始（NCT02396134），目的是评估优化剂量的PepVax 疫苗对HCT 受者的保护功能，并研究该疫苗接种后在接受干细胞移植的患者中减少发生严重CMV 感染的效果，以评估该疫苗的保护效益。这项试验参与者为133 名CMV 血清阳性的HCT 接受者，随机分配为两组，在接受CMV 血清特异性抗体阳性的HCT 治疗的同时，接受该疫苗或安慰剂治疗，并在未来的一年中接受随访观察，暂时无具体试验结果公布，这将进一步确定该疫苗策略在HCT 环境中的作用和影响。当前研究的数据表明，最近开发的CMVPepVax 疫苗迅速扩增了具有记忆效应表型的CMV 特异性T 细胞，这通常在未接种疫苗的HCT 患者发生病毒血症的CMV 再激活后出现。这些特性使CMVPepVax 疫苗成为进一步临床评估的有希望的候选者。尽管如此，CMVPepVax 只能用于HLA A*0201 接受者（约占40%），这是该疫苗的一个重大限制[24]。

2.3 基因疫苗

2.3.1 DNA 疫苗 ASP0113 疫苗是由美国Vical公司开发，现由日本的Astellas 公司接管，是一种DNA 疫苗，由两个编码gB 和pp65 的质粒构成。已经完成了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验，但是结果却证明该疫苗缺乏疗效，主要是由于DNA 疫苗本身就较难产生强的免疫原性。在Ⅰ期临床试验中，试验过程没有发生严重不良事件，表明该疫苗耐受性良好，但该疫苗与对照组相比没有增强抗体反应。Ⅱ期临床试验的受试者为HCT 受者。与对照组相比，疫苗组可检测到的 CMV 病毒血症的发生率显著降低（P=0.008），CMV 病毒血症发作次数更少 （P=0.017），虽试验中出现不良反应，但差异没有统计学意义，所以该试验认为疫苗的耐受性良好[25]。在另一项Ⅱ期临床试验中，目的是评估疫苗ASP0113 在CMV 血清特异性抗体阴性肾移植受者中接受来自CMV 血清特异性抗体阳性供体的器官的有效性和安全性。结果表明，疫苗组与对照组之间的差异在统计学上没有显著意义 （OR=0.79，95%CI：0.43～1.47，P=0.307）。疫苗组与对照组的移植受者之间对pp65 的平均T 细胞反应和平均gB 抗体水平相似。且疫苗组和对照组受试者在第一次研究药物注射后一年内CMV 病毒血症的发生率差异无统计学意义。结果表明该疫苗在CMV 血清特异性抗体阴性的肾移植人群中无效但安全[26]。在一项目的是评估该疫苗在接受HCT 的CMV 血清特异性抗体阳性受体中的保护功效和安全性的Ⅲ期临床试验中，514 名CMV 血清特异性抗体阳性HCT 接受者，随机接受疫苗或安慰剂。疫苗组与对照组之间的gB 特异性抗体反应总体上差异无统计学意义（P=0.112）。该疫苗在降低总体死亡率和CMV 感染终末器官病变方面没有效果，并且在同种异体HCT 受者移植后1 年期间，在降低CMV 病毒血症方面似乎也没有效果。此外，与对照组相比，ASP0113 并未引起有效的T 细胞或B 细胞反应，与对照组安全性结果相似。由于缺乏疗效，ASP0113 的开发已被终止[27]。尽管接种ASP0113 的受者CMV 病毒血症的首发时间较长，CMV 病毒血症的发生率较低，但未能达到减少需要抗病毒治疗的CMV 病毒血症的主要终点。

2.3.2 病毒载体疫苗 希望之城三联疫苗由美国希望之城医疗中心研发，是一种表达与保护性免疫相关的CMV 抗原的重组减毒痘病毒修饰的安卡拉痘苗 （MVA），该疫苗可表达来自CMV 的3 种免疫优势抗原（pp65、IE1、IE2），是一种高度减毒、非增殖性病毒载体疫苗。对该疫苗的首次临床评估的Ⅰ期临床试验证明该疫苗在健康成人中具有良好的耐受性和高度免疫原性[28]。一项Ⅱ期临床试验中，在高危异基因HCT 接受者中完成了对该疫苗安全性和疗效的研究：将102 例需要接受HCT 治疗的CMV 血清抗体阳性患者随机分为疫苗组和对照组，在移植后的前100 d 内，5 例三联患者（9.8%）和10 例安慰剂患者（19.6%）发生CMV 再 激 活（HR=0.46，95%CI：0.16～1.4，P=0.075），证明接种该疫苗后发生CMV 事件的风险下降了一半。疫苗组的免疫应答显著增加，如CD137+CD4+和CD137+CD8+pp65 特异性T 细胞在接受HCT 后的第100 天以及1 年后显著增强。在整个1 年的观察期内，抗病毒药物的使用率，对照组为25.5%，而疫苗组为19.6%。尽管疫苗组接种前后3 级或4 级急性移植物抗宿主病发生率较高，但没有超过预期。三联疗法耐受性对于血清特异性抗体阳性的HCT 接受者来说很好，在预防病毒血症和改善CMV 特异性T 细胞重建方面明显优于对照组。这是第一个通用的 （非HLA 特异性）、基于病毒载体CMV 疫苗，可以安全地在免疫抑制患者中诱导强大而持久的CMV 特异性T 细胞反应[29]。

HB-101 疫苗是由美国Hookipa Pharma 公司研发，载体为非复制型淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV），编码必需糖蛋白的LCMV 基因被编码gB 或pp65 蛋白的基因取代。表达gB 的rLCMV 载体编码缺乏来自CMV 株 Merlin 的细胞质结构域的C 端截短形式的gB，而表达pp65 的rLCMV 载体编码来自CMV 株AD169 的未修饰的pp65 蛋白。该疫苗是等量的pp65 和gB 表达载体的混合物。在一项Ⅰ期临床试验中，共有54 名CMV 血清阴性受试者，目的是评估该疫苗在3 种不同剂量下对抗CMV 的安全性和免疫原性。该疫苗在所有剂量水平下均具有良好的耐受性，并且没有报告严重不良事件。试验结果是低剂量时未诱导出LCMV 载体中和抗体。发现gB 结合和中和抗体均出现剂量依赖性反应。高剂量组和中剂量组中的所有疫苗接种者 （100%）在第三次接种后都产生了gB 结合和中和抗体，在低剂量组中反应率为93%。在3 次给药后，分别在71%、93%和86%的低、中和高剂量接受者中检测到对gB和/或pp65 特异性细胞因子CD8+T 细胞反应。该研究表明HB-101 疫苗在高达100%的接受者中引发了CMV 特异性体液反应，在高达93%的接受者中引发了功能性细胞反应。伴随这些CMV 特异性T 细胞反应，HB-101 诱导了LCMV NP 特异性、分泌IFN-γ 的T 细胞，这些载体特异性T 细胞的存在并不能阻止HB-101 对CMV gB 或pp65 特异性T 细胞的加强。HB-101 疫苗是迄今为止测试过的最有效的CMV 疫苗。CMV 特异性和 LCMV 特异性T 细胞反应是否以及在何种程度上可以竞争仍有待研究。当前研究中的受试者在研究开始时均为CMV 血清抗体阴性，未来的研究中将包括血清抗体阳性的受试者[30]。

3 小结与展望

综上所述，目前已有多种CMV 疫苗进入不同阶段的临床试验研究，甚至DNA 疫苗已经进入Ⅲ期临床试验，但疫苗的有效性和安全性还有待进一步研究，所以至今尚无CMV 疫苗进入临床使用。相信随着人们对CMV 免疫学及保护机制的研究不断深入和科研技术的不断进步，安全有效的CMV疫苗上市指日可待。