基于骨组织工程的骨再生策略

陈泽驹，冯少龙，刘桂宏，刘宇，刘青华，蒋煜文

·综述·

基于骨组织工程的骨再生策略

陈泽驹，冯少龙，刘桂宏，刘宇，刘青华，蒋煜文

519000 广东，暨南大学附属珠海医院（珠海市人民医院）创伤骨科

骨组织能支撑肌肉，支持机体运动并保护重要的器官，并调节矿物质稳态和身体的内分泌功能。虽然骨骼的自我愈合能力很强，但大面积的骨缺损阻碍了骨折的愈合[1]。创伤性损伤、骨肿瘤切除或先天性的缺陷都会导致骨不连或大面积骨缺损，并且与创伤严重程度、高龄、糖尿病等因素高度相关。骨不连的常见治疗方法包括自体骨移植和同种异体骨移植，然而这些治疗方法在骨的修复和再生中都存在不少局限。

自体骨移植是目前修复骨不连的常用方法，它从患者的髂嵴取骨并移植到骨折部位，具有良好的组织相容性和非免疫原性[2]。自体移植物中含有生长因子（GF）、骨祖细胞和三维（3D）基质，它们是骨诱导、骨传导和骨整合的重要组成部分。然而，自体骨移植存在一定的缺点，比如出血、炎症、感染和慢性疼痛，以及供体部位损伤和畸形、过敏、瘢痕等[3]。此外，自体骨移植的来源有限，不能处理大面积的骨缺损[4]。异体骨移植是治疗骨不连的另一常见治疗选择，但也有缺乏供体、病毒性疾病传播、细菌感染或免疫排斥等风险[1]。自体移植和同种异体移植的这些局限性和缺点推动了骨组织工程骨再生方法的发展。

组织工程和再生医学为损伤骨组织再生和愈合[5]提供了更为先进的方法。本文综述了基于骨组织工程的骨再生策略，强调了关键问题和相应的困难，同时梳理了骨组织工程的应用和进展。

1 骨再生与骨组织工程

1.1 骨组织工程与再生的生物材料

骨再生有三个基本特征：骨诱导、骨传导和骨整合。骨诱导是指来自植床周边宿主结缔组织中的可诱导成骨前体细胞，在诱导因子的作用下产生骨原细胞，并经成骨细胞形成新骨。因此，骨诱导物质可以通过间充质干细胞[6]的招募、增殖和分化来直接诱导成骨。而骨传导是骨再生材料提供微环境并使原位成骨发生的能力。骨整合是指植入体与骨组织之间呈现的无纤维结缔组织界面层的直接接触。

生物材料需要具有生物相容性，与宿主的生物液体、组织和细胞能够和谐存在，并且不会对局部或系统产生有害影响。其化学特征需要适合细胞黏附、增殖和分化。此外，它的孔隙大小、形状和孔隙率可以促进细胞的定植和血管化。

当前有许多材料都运用于骨再生策略，包括天然聚合物和合成聚合物[7]，如蛋白质、多糖糖胺聚糖、聚乙醇酸（PGA），聚乳酸（PLA）、聚 ε-己内酯（PCL）等、无机生物材料、金属（如钛金属及其合金等）和陶瓷[如氧化铝、氧化锆、磷酸钙陶瓷（CaPs）、磷酸钙水泥（CPCs）等]，以及它们组合构成的复合体。

聚合物是一类重要的骨组织工程材料。天然聚合物中有胶原、壳聚糖、藻酸、弹性蛋白和纤维素，它们都已运用于再生和组织工程。其酶解和水解赋予了材料可吸收性[8]。合成聚合物则是一种具有更佳性能的材料。FDA 批准使用的合成聚合物包括：聚乳酸（PLA）和聚乙醇酸（PGA），这两种聚合物表现出非常好的力学性能；PCL 与人类间充质干细胞（MSC）[9]具有很大的相容性，且降解速率较慢。高机械强度的聚合物有聚对苯二甲酸丁二酯（PBT）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET），它们都具有优良的生物相容性、可生物降解性和抗冲击性[10-11]。然而，有研究发现了 PET 在过热或长期使用条件下可能会释放邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）这种致癌物质[12]，因此在生物医学的应用中需要进一步研究。

金属材料机械强度较高，由钛、镁或不锈钢等金属制成的植入物已经用于制作关节假体、钢板和螺钉。近年来，研究者开发了不少金属多孔支架来支持骨组织的再生。Van Bael 等[13]在氧化表层涂层中加入银纳米颗粒，开发钛植入物，从而降低植入物相关感染的风险。但金属支架的使用仍存在不少局限，包括不可降解性、离子释放和感染风险等。其中，不可降解性是限制金属作为支架材料的主要缺点。金属支架在细胞黏附并形成新的骨组织后，并不会随着时间的推移而降解。有学者发现镁合金多孔支架可以在体内腐蚀降解[14]，从而解决这一问题。

陶瓷是无机非金属材料[15]。如磷酸钙陶瓷（CaPs）和生物活性玻璃（BG）[16]，它们有优良的力学性能，为新组织形成[2]提供了一个合适的界面。但陶瓷与皮质骨相比韧性更低、杨氏模量更高，这使得它们不适合修复负重骨[17]。在骨组织工程中最常用的 CaPs 由羟基磷灰石（HA）、磷酸三钙（TCP）组合而成，称为双相磷酸钙（BCP）[18]。它们的成分与天然骨相似，具有良好的生物相容性、骨电导性，并利于骨整合[19]。

复合材料指由属于相同或不同类别材料的两种或两种以上的基底制成的支架[20]。目前已开发的金属-陶瓷复合材料可以同时发挥两者的最佳力学性能[21-22]。羟基磷灰石和氧化铝可以协助机体形成新骨[23]，通过与戊二醛、壳聚糖和明胶化学交联形成相互连接的凝胶状结构，支持成骨前细胞和人骨髓间充质干细胞[24]的黏附、浸润、增殖和功能的发挥。HA 和 TCP 组合而成的 BCP 已运用于提高支架的降解性[25]。I 型胶原蛋白和生物磷灰石是生理骨组织的主要成分，所以模拟骨骼自然功能的最佳选择是使用聚合物-陶瓷复合材料，比如纳米羟基磷灰石/聚-ε-己内酯[26]、壳聚糖/磷酸钙[27]等。HA 已用于改善 PLA[28]等聚合物的力学性能以及骨细胞在这些表面上的附着和成熟[29]。然而，目前还没有支架能够在血管形成、可吸收性及骨再生方面完美地模拟骨的结构特征。因此，大多数研究都集中于在支架中添加活性的生物分子和细胞，以再现在生理组织再生过程中发生的信号级联。复合材料通过结合聚合物和陶瓷生物材料模拟自然组织，可以确保更好的强度、足够的免疫反应和生物降解性。虽然目前的研究从生物力学的角度显示了令人欣喜的结果，但需要长期的研究来促进临床转化。

1.2 骨组织工程和再生中的支架成型策略

骨科临床实践需要解决的一个关键问题是修复大面积骨缺损。当前，没有一种生物材料单独具有理想的性能来有效地模拟骨组织[30]。因此，大部分研究都把重点放在组合材料的开发、分子和细胞的功能化以及组建新型支架。骨组织工程中的支架可以进行功能化来提高它的性能，血管化支架、机械结构化支架、梯度支架、仿生支架等都能够有效提高支架内在性能、促进骨愈合再生。

血管化在骨组织再生中具有重要作用，许多研究都力求促进血管生成。除了控制支架微结构和孔隙率来支持新血管化，通过生物材料传递血管生成因子也是一种促进血管生成的策略。具有代表性的血管生成因子包括金属离子和生长因子[31]。Quinlan 等[32]证实，钴能够诱导血管生成和促进成骨。Li 等[33]发现硅多孔支架可增强成骨作用。另有学者已将硅这种成骨细胞矿化的重要元素用于骨再生目的，在胶原蛋白和羟基磷灰石复合材料中加入硅酸锌可增强体内骨血管生成，调节单核细胞，创造良好的成骨微环境[34]。此外，生长因子对骨组织的再生有重要作用，它在损伤部位提供信号，使骨祖细胞和炎症细胞迁移并启动愈合过程[35]。因此，支架除了模拟骨的机械结构外，还应有血管生成因子等生物活性分子，引导支架血管化，从而发挥出更强的成骨再生作用。

支架的机械强度主要由孔隙率控制，调节这项参数[36]来获得优良的平衡是重中之重。Torstrick 等[37]创建了表面多孔聚醚醚酮（PEEK）支架，与平滑的 PEEK 相比，这种表面多孔 PEEK（PEEK-sp）结构具有高抗拉强度、抗疲劳性和更好的整合性。然而，尚不清楚孔隙结构的孔径、孔度或孔隙层厚度对 PEEK 植入体生物力学性能的影响。另外，3D 打印技术可以通过自主设计来调控支架的孔隙大小，从而改良支架材料的内在性能。若支架孔隙率过高，会导致其力学性能下降；反之，孔隙率过低则不利于新骨生长，使植入体内的支架无法达到预期效果[38]。国内学者通过实验得出孔隙率为 60% 的骨组织工程支架的宏、微观孔隙结构与力学强度等综合性能表现最优[39]，可使支架更好地发挥支撑细胞和生长因子的作用，提高成骨效率，促进骨缺损修复。在现有的制造技术中，3D 生物打印技术正在快速发展，在微规模、高通量和细胞沉积方面有着巨大的优势[40]，是非常有发展前景的新技术。

梯度支架能够重建复杂的软骨-骨界面，代表了骨软骨缺损治疗的一个进展，也是治疗骨软骨损伤的良好候选材料。绵羊体内实验研究结果表明，这种复合材料安全、易于使用，是促进骨软骨再生[41]过程的合适支架。随后的马匹研究也显示骨软骨缺损填充良好，无任何炎症反应[42]。在另一临床研究中，采用梯度支架治疗膝关节软骨或骨软骨病变缺损，平均缺损大小1.5 ～ 6 cm2，在临床评分和 MRI 评估中，均观察到病变部位显著的骨再生改善[43-44]。

仿生支架运用于治疗年轻或疾病早期患者的研究也获得了积极的结果[45]。骨关节炎是最普遍的关节疾病，目前还没有根治的治疗方法，在这类人群上测试运用仿生支架是为了逆转不利环境，启动组织再生，从而减缓或防止疾病进展。但目前需要进一步的研究来更好地证明这种治疗的实际有效性。Berruto 等[46]利用仿生支架治疗膝关节骨软骨病变，也取得了良好的疗效。这种新方法能够诱导原位再生，恢复软骨或软骨下骨，降低软骨表面修复的成本和技术挑战，并可运用于较为复杂的相关病例。

许多已运用于支架生产的传统技术方法显示出优良的物理化学性能，并具有低成本的社会效益特点。而近年来所发展的先进制造技术（如 3D 打印）、超临界流体技术和微流体技术可以使缺陷组织再生复杂结构，提高孔隙率、结构和机械性能以及细胞的黏附。

修复受损骨组织需要采用合适的支架成型策略，用开创性的方法、设计和技术来充分治疗和替换受损组织，并重建组织功能。这些策略有非常大的潜力来缓解骨移植手术的高成本和负面作用，并成为再生和修复受损骨组织的替代方法，提高社会经济效益。

2 骨再生的细胞成分

骨再生中有不少细胞可用于构建骨结构，包括成骨细胞、胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（iPSC）和间充质干细胞（MSC）。成骨细胞是一种自体细胞来源的细胞，但它们的数量有限，增殖潜能较低。ESC 是来自囊胚内团的多能细胞，适合再生医学的应用，但由于畸胎瘤发展的风险、免疫不相和以及伦理问题，其应用仍存在争议。iPSC 能克服上述对 ESC 的担忧，同时也显示出了不错的分化潜力。而骨组织的巨大再生潜力无疑在于间充质基质细胞。骨髓间充质干细胞（BMSC）可分化为成骨细胞和软骨细胞，并进行软骨内成骨[47]，因此比 ESC、iPSC 和成骨细胞更适合于骨组织工程[48]。BMSC 除了可塑性外，其趋向性可以使它们迁移并回到受伤的部位，以响应特定的信号[49]，是最有前途的异体治疗细胞。有研究证明，脂肪来源的间充质干细胞比 BMSC 可以发挥更多的免疫调节作用[34]；另一方面，它表现出更好的免疫逃逸[50]，说明异体免疫反应的风险最小[34]。

一些研究通过将 MSC 应用于细胞治疗和组织工程策略[51-52]来增强骨的再生。基于 MSC 的治疗包括骨髓移植和体外培养[53]扩增治疗。BMSC 治疗已在多个临床应用中进行了评估，包括骨折愈合、骨不愈合、各种颌骨缺损和预防骨坏死，揭示了其安全性和潜在疗效[53]。然而，BMSC 治疗存在一些局限性，特别是移植后生存时间短、最佳剂量和给药途径尚不清楚[54]等。

在 2015 年，有学者开发出一种衍生自人类胚胎的干细胞（hESC），通过诱导分化为滋养层样细胞[55]，然后再进一步分化为胚胎来源间充质干细胞（T-MSC）。与成体 MSC相比，T-MSC 不受供体获得性和差异性的限制，也不存在 MSC 因体外扩增而丧失治疗效果的风险。在非人灵长类动物试验中证实了 T-MSC 治疗骨关节炎的有效性[55]。这使 T-MSC 在未来的骨再生细胞研究中具有不错的发展前景。

因此，到目前为止没有一种基于 MSC 的产品成为骨再生的标准。在 MSC 的应用中仍存在一些挑战，例如质量控制、细胞的组织来源等，其转化应用依然面临着在制造和分析过程方面与标准化方面的相关问题。

3 骨再生的生长和分化分子

涉及骨组织再生研究最多的分子是骨形态发生蛋白（BMP）[56]、转化生长因子β（TGFβ）、血管内皮生长因子（VEGF）和血小板源性生长因子（PDGF）。BMP 在间充质干细胞的趋化、有丝分裂和成骨分化以及促进血管生成[57]的过程中发挥作用。重组 BMP-2 改善了 Mg/HA 支架对骨形成的影响，促进了 Mg[58]的成骨和血管生成作用。尽管在聚合物中添加 BMP-2 不足以支持骨修复[59]，但当 BMP-2 与 HA 结合时，可促进矿化骨形成[60]。此外，BMP-9 已运用于复合支架的功能化，表现出了在体外促进骨髓间充质细胞分化为成骨细胞和增强体内骨形成的能力。VEGF 可促进血管生成和骨的再生[61]；PDGF 是一种能够诱导血管生成的有丝分裂生成原，它也有能力改善骨再生，增强周围组织的血管化。Kirby 等[62]在 PCL 支架内开发了一种基于 PLGA 的传递系统，它包含了 VEGF、PDGF 和 BMP-2，且可以使这些因子转化成 PLGA 微粒。这些生长和分化分子在骨再生过程中都发挥着重要的作用。

4 小结

目前已经有许多关于骨再生策略的研究，但最佳的治疗方法仍未有定论[63]。基于骨组织工程的骨再生策略，尝试提供能够分化为成骨细胞的细胞、生长和分化因子以及支持细胞附着、迁移和增殖的可降解支架来模拟骨愈合的自然过程。虽然自体移植仍然是目前骨修复的常用方法，但骨组织工程的快速进展使骨再生技术不断向临床实践的方向推动。这些新技术为解决骨愈合不良问题提供了一个非常有前景的解决方案，帮助临床医师应对骨不连或大面积骨缺损给患者带来的负面影响，并切实提高患者的生活质量，减轻家庭和社会经济负担。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.008

蒋煜文，Email：jywjyw71@163.com

2021-10-29