利拉鲁肽中长链脂肪酸——棕榈酰谷氨酸残留量的检测方法研究

胡馨月，孙悦，张慧，吕萍，李晶，梁成罡

·论著·

利拉鲁肽中长链脂肪酸——棕榈酰谷氨酸残留量的检测方法研究

胡馨月，孙悦，张慧，吕萍，李晶，梁成罡

102629 北京，中国食品药品检定研究院激素室/国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室/国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室

建立超高效液相-高分辨质谱法测定利拉鲁肽中的长链脂肪酸——棕榈酰谷氨酸残留量检测方法，为长效脂肪酸修饰型胰岛素和胰高糖素样肽-1 类似物的脂肪酸残留量检测提供思路。色谱柱ACQUITY UPLC peptide BEH C4（2.1 mm × 150 mm，2.7 μm）；流动相 A 为甲酸/水（1:1000，/），流动相 B 为甲酸/乙腈（1:1000，/），梯度洗脱：0 ～10 min，35% ～ 95% B；10 ～ 10.5 min，95% ～ 35% B；10.5 ～ 15 min，35% B。流速 0.3 ml/min，柱温 50 ℃，样品盘温度 25 ℃，检测波长 214 nm，进样体积 2 μl。利用超高效液相色谱质谱联用技术（UPLC-MS），在正离子电喷雾离子化（ESI+）选择性离子检测（SIM）模式下（检测离子分子式为 C21H39NO5，[M+H+] m/z 386.2901），测定利拉鲁肽中棕榈酰谷氨酸的残留量。该方法专属性强，棕榈酰谷氨酸与利拉鲁肽分离度良好，棕榈酰谷氨酸在0.0125 ～ 2 μg/ml 的范围内峰面积与浓度有良好的线性关系（= 1.000），方法平均回收率为 98.2%（= 9），RSD% 为 3.7%。经方法学验证，本法能准确测定利拉鲁肽中棕榈酰谷氨酸残留量，方法精密度、重复性、准确度和耐用性良好，并且为类似产品的脂肪酸残留量检测提供一定的借鉴和数据支持。

利拉鲁肽； 液质联用； 工艺相关杂质； 棕榈酰谷氨酸； 高分辨质谱； 选择性离子检测

胰岛素类和胰高糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）类药物是糖尿病治疗的主要药物，两者虽作用机制不同，但均可发挥良好的降糖作用，是控制 2 型糖尿病的有效药物。天然的胰岛素和 GLP-1 的半衰期很短[1-3]，患者给药频繁，依从性较差。随着 DNA 重组技术的发展，可以通过改变其天然结构使药物缓慢地吸收和分布，达到较长的半衰期，减少患者给药次数。其中，经基因工程表达和化学修饰，得到一类脂肪酸修饰型的胰岛素类似物（如德谷胰岛素和地特胰岛素）和 GLP-1 的类似物（如利拉鲁肽和司美格鲁肽），这类产品是在序列中某个氨基酸侧链上（如赖氨酸）增加脂肪酸基团，该结构的改变提高了药物与白蛋白的结合能力，延长了在血浆中的存留时间，达到长效的目的。在生产过程中，长链脂肪酸（或带有活性基团）为过量投料，虽经过一系列的纯化步骤，但是其仍有残留。根据2020 版《中国药典》四部通则、ICH Q3A 指导原则以及2020 版《中国药典》三部人用重组 DNA 蛋白制品总论[4]的相关要求，需要对其残留量进行检测与控制，以确保产品的纯度和质量。

利拉鲁肽为脂肪酸修饰型的 GLP-1 类似物，氨基酸序列与天然 GLP-1 分子仅有一个氨基酸的差异，即 34 位赖氨酸被精氨酸取代，在 26 位赖氨酸上增加一个谷氨酸介导的 16 碳棕榈酰脂肪酸侧链[5-6]（图 1），其半衰期延长至 13 h[7-8]。脂肪酸修饰工艺复杂，多数利拉鲁肽生产工艺中，化学修饰部分实际投料为棕榈酰谷氨酸活性酯，但多数活性酯成分极其不稳定，最终可能以工艺相关杂质棕榈酰谷氨酸的形式存在于终产品中。根据已上市同类产品的注册标准，有部分企业将该项目纳入到注册标准中。棕榈酰谷氨酸为长链脂肪族二羧酸，疏水性强，紫外吸收较弱，残留量低，建立一套专属性强、灵敏度高的检测方法十分必要。本研究以利拉鲁肽中的长链脂肪酸——棕榈酰谷氨酸残留量检测为例，通过液质联用技术的选择性离子检测（selected ion monitor，SIM）模式[9-10]，建立了专属性好、准确度高、线性范围宽、耐用性强的棕榈酰谷氨酸残留检查方法，提高了利拉鲁肽的质量控制水平，并且为其他类似产品的长链脂肪酸残留提供借鉴。

图 1 利拉鲁肽和棕榈酰谷氨酸的结构式

Figure 1 Structural formulas for liraglutide and N-palmitoyl-L-glutamic acid

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Orbitrap Exploris 480 质谱仪和 Xcalibur 数据处理软件为美国 ThermoFisher 公司产品。

1.1.2 材料 棕榈酰谷氨酸对照品为中检院激素室留样，含量 96.0%；利拉鲁肽供试品为中检院激素室留样，来源于企业 A、B、C，共 7 批，分别标号 A1、A2、A3、B1、C1、C2、C3；LC-MS 级甲酸和乙腈为美国 Fisher Scientific 公司产品；氨水（纯度> 99.0%）为美国 Sigma 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 液质分析方法

1.2.1.1 液相色谱条件 色谱柱ACQUITY UPLC peptide BEH C4（2.1 mm × 150 mm，2.7 μm）；流动相 A 为甲酸/水（1:1000，/），流动相 B 为甲酸/乙腈（1:1000，/），梯度洗脱：0 ～ 10 min，35% ～ 95% B；10 ～ 10.5 min，95% ～ 35% B；10.5 ～ 15 min，35% B。流速 0.3 ml/min，柱温 50 ℃，样品盘温度 25 ℃，检测波长 214 nm，进样体积 2 μl。

1.2.1.2 质谱条件 采用 ESI+电喷雾电离源，在正离子模式下进行质谱检测分析。毛细管电压 3.8 kV，源温度 350 ℃，鞘气 35 Arb，辅助气10 Arb，离子传输管温度 320 ℃，正离子喷雾电压 3800 V，数据检测模式为选择性离子检测（SIM），一级分辨率为 60000 @m/z 200，检测离子分子式为C21H39NO5，[M+H+] m/z 386.2901，其余设置默认值。1.2.1.3 数据处理 Xcalibur 软件进行数据采集和定量处理，设置提取产物离子 m/z 386.2890，设置偏差 5 ppm，高斯平滑数值 7，保留时间6.28 min。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 稀释溶剂氨水/水（1:1000，/）的制备 量取 1000 ml 超纯水，加入 0.1 ml 氨水，混匀。

1.2.2.2 供试品与对照品的制备

⑴棕榈酰谷氨酸对照品的制备

对照品贮备液 1：取 N-十六酰基-L-谷氨酸对照品约 10 mg，置 50 ml 量瓶中，加溶剂适量，超声约 2 min 溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取 1 ml，置 10 ml 量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。取对照品储备液适量分别配制浓度为 2（0.5%）、1.2（0.3%）、0.8 μg/ml（0.2%）三个点，然后自 0.4 μg/ml（0.1%）点起由上一个浓度点进行 1 倍稀释，分别配制0.2（0.05%）、0.1（0.025%）、0.05（0.0125%）、0.025（0.00625%）和 0.0125 μg/ml（0.003125%），共9 个点，每个浓度进样 2 针。

⑵利拉鲁肽供试品溶液的制备

取供试品约 10 mg，置 25 ml 量瓶中，加稀释溶剂适量，振摇使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

⑶精密度和重复性样品制备

取供试品 A2 溶液作为精密度考察溶液，重复进样 6 针；人员 A 和人员 B 分别在不同日期平行配制 6 份供试品 A2 溶液，每份重复进样 2 针。

⑷线性范围样品制备

按照1.2.2.2 ⑴项下配制对照品系列线性溶液：2（0.5%）、1.2（0.3%）、0.8（0.2%）、0.4（0.1%）、0.2（0.05%）、0.1（0.025%）、0.05（0.0125%）、0.025（0.00625%）和0.0125 μg/ml（0.003125%）。

⑸准确度样品制备

称取20 mg供试品C1 置于25 ml 容量瓶中，加稀释溶剂适量，振摇使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀。与2.4、0.8 和0.2 μg/ml 的对照品溶液等体积混合，加标至棕榈酰谷氨酸终浓度为1.2（0.3%）、0.4（0.1%）和0.1 μg/ml（0.025%）3 个浓度水平，每个浓度水平平行配制3 份，另单独取供试品C1 约10 mg，置25 ml 量瓶中，加稀释溶剂适量，振摇使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，配制1 份。

1.2.3 计算方法

标准曲线法：y = ax + b

x：棕榈酰谷氨酸实测浓度（μg/ml）；y：峰面积；b：标准曲线截距；a：标准曲线斜率。

含量（%）公式如下：含量（%）=[棕榈酰谷氨酸实测浓度（μg/ml）/利拉鲁肽浓度（μg/ml）] × 100%

2 结果

2.1 色谱柱与梯度选择

棕榈酰谷氨酸为 16 个碳的脂肪酸，具有较强的疏水性。本研究选择保留性能相对弱的 C4 色谱柱，经方法优化，0 ～ 10 min 中，B 相 35% ～ 95% 中利拉鲁肽和棕榈酰谷氨酸依次洗脱。对比紫外色谱图（214 nm）和 SIM 图（m/z 386.2890），利拉鲁肽保留时间约为 4.09 min（图 2A），棕榈酰谷氨酸的保留时间约为 6.28 min（图 2B），结果表明，利拉鲁肽与棕榈酰谷氨酸分离度良好。

2.2 质谱 SIM 模式选择和定量方法

采用数据依赖采集（MS）模式，一级分辨率为 60000 @m/z 200，对供试品A2 溶液进行一级质谱采集，棕榈酰谷氨酸理论质谱图和实测质谱图如图 3 所示，实测分子离子峰 m/z 386.2890，主要同位素峰相对丰度比与理论图谱一致。选择 SIM 模式下采集，检测离子分子式为 C21H39NO5，m/z 386.2901（+H），一级分辨率 60000，提取离子 m/z 386.2890，可以得到单峰，无干扰，且信号强度为e7，强度较高，可满足定量分析要求。选择标准曲线法定量，系统适用性规定相关系数应≥ 0.990。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性 分别将氨水/水（1:1000，/）、对照品溶液、供试品溶液、加标溶液依次进样。氨水/水对测定无干扰，且利拉鲁肽与棕榈酰谷氨酸峰分离度良好。结果表明，方法专属性良好。

2.3.2 精密度测定 供试品 A2 重复进样 6 针，含量（%）平均值为 0.12%，RSD% 为0.31%，人员 A 平行配制供试品 A2 共 6 份，含量（%）平均值为 0.12%，RSD% 为 2.2%；人员 B 平行配制供试品 A2 共 6 份，含量（%）平均值为 0.11%，RSD% 为 4.6%；人员 A 与人员 B 测定的平均含量为 0.12%，RSD% 为 4.5%。以上结果表明，方法精密度良好。

2.3.3 线性和准确度测定

2.3.3.1 线性与范围 分别取浓度约为 2、1.2、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 和 0.0125 μg/ml 的对照品系列线性溶液进样，每个浓度进样 2 针，以测得的棕榈酰谷氨酸峰面积平均响应值为纵坐标，以棕榈酰谷氨酸浓度作为横坐标绘制线性回归曲线，线性方程为y = 219 959 080.85x + 2 493 292.39，2= 1.00，= 1.000（图 4）。样品在 0.0125 ～2 μg/ml 范围内峰面积与浓度线性良好。线性范围浓度最低点0.0124 ng/ml 为该方法定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）。

2.3.3.2 准确度 按照1.2.2.2 ⑸项下方法，加标至棕榈酰谷氨酸为 1.2（0.3%）、0.4（0.1%）、0.1 μg/ml（0.025%），每个浓度平行配制 3 份，供试品 C1 配制 1 份。如表 1 所示，代入标准曲线计算，供试品溶液 C1 未检出棕榈酰谷氨酸，测得棕榈酰谷氨酸的平均加样回收率为 98.2%，RSD% 为 3.7%（= 9）。

2.3.4 耐用性 改变流速至 0.4 ml/min，线性回归方程为 y = 184 372 213.45x + 3 270 487.20，2= 1.00，= 1.000，供试品 A2 测定值为0.11%，改变正离子喷雾电压至 3900 V，线性回归方程为y =213 186 726.58x + 3 017 086.87，2= 1.00，= 1.000，供试品 A2 测定值为 0.11%。结果表明，方法耐用性良好。

2.3.5 溶液稳定性 样品放置在 25 ℃下，分别于 0、3、6、9、12、18 和 24 h 对供试品 A2 进行测定，标准曲线法计算，含量（%）均为 0.12%，峰面积 RSD% 为 1.0%，方法稳定性良好（表 2）。

2.4 样品测定

按照1.2.2.2 ⑵项下供试品配制方法，对三家企业的 7 批利拉鲁肽原料进行棕榈酰谷氨酸含量（%）测定，结果见表3。

图 2 供试品的紫外色谱图（A）和 SIM 色谱图（B）

Figure 2 UV chromatograms (A) and SIM chromatograms (B) of the samples

图 3 棕榈酰谷氨酸理论质谱图（A）和实测一级质谱图（B）

Figure 3 Theoretical mass spectrometry (A) and measured first-order mass spectrometry (B) of N-palmitoyl-L-glutamic acid

3 讨论

药物中杂质的常规检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等。这些方法的灵敏度只需要满足杂质的最低报告限度（单日最大剂量≤ 2 g，0.05%；单日最大剂量> 2 g，0.03%）即可[11]。但在药物中的残留量可能远低于报告限度，常规杂质分析方法检测灵敏度低、耗时长，难以满足其检测需求。随着质谱技术的发展，色谱技术（如液相色谱、气相色谱等）联用质谱检测器具有高灵敏度和高分辨率[12]。本研究即采用液质联用的定量方法，选择 SIM 的相对定量技术，选取一级分子离子 m/z，标准曲线法定量，系统适用性规定相关系数≥ 0.990。本方法具有较高的灵敏度，棕榈酰谷氨酸在 0.0125 ～ 2 μg/ml 范围内峰面积与浓度线性良好。由于生产过程中棕榈酰谷氨酸（酯）投料比和纯化工艺不同，不同企业的棕榈酰谷氨酸残留量也各不相同。采用本研究建立的方法对三家企业不同批号的棕榈酰谷氨酸残留量进行测定，发现不同企业的棕榈酰谷氨酸残留有明显的差异。部分批次原料有超出确证阈值（单日最大剂量≤2 g，0.15%；单日最大剂量> 2 g，0.05%）的风险，超出确证阈值的杂质均应基于其生物安全性评估数据，确定控制限度。为保证提高利拉鲁肽的纯度、质量和有效性，企业可根据自身纯化工艺、分析成本等方面考量，需考虑将棕榈酰谷氨酸残留降至较低水平。

图 4 对照品系列线性溶液与峰面积拟合曲线

Figure 4 Curve fitting between linear solution and peak area of reference substance series

表 1 三个浓度水平的加标回收率（n = 9）

表 2 稳定性测定

表 3 三家企业棕榈酰谷氨酸含量结果（%）

注：“/”未检出。

Note: “/” not detected.

本研究方法同时也为类似产品的脂肪酸侧链的残留量检测提供了一定的思路，脂肪酸侧链一般具有疏水性较强、紫外吸收较弱等共性特征，这对方法灵敏度提出了一定挑战。选择液质联用的定量方法，若在一级 SIM 模式下，专属性及灵敏度均良好，可直接采用该模式定量，本研究工作提供的数据和方法可作为参考。另外，也可以选择多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，选择定量离子对进行相对定量。

综上所述，本研究建立的液质联用法测定棕榈酰谷氨酸残留量，精密度、准确度和专属性较高，可作为利拉鲁肽生产过程中棕榈酰谷氨酸残留量的质控方法，用于过程控制及终产品放行控制。随着深入的研究，该方法具有更广泛的适用性，可以为类似产品的脂肪酸残留量检测提供借鉴和数据支持。

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Establishment of a method for determination of N-palmitoyl-L-glutamic acid residue in liraglutide

HU Xin-yue, SUN Yue, ZHANG Hui, LYU Ping, LI Jing, LIANG Cheng-gang

Author Affiliation: Division of Hormone, National Institutes for Food and Drug Control, NHC Key Laboratory of Research on Quality and Standardization of Biotech Products, NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Chemical Drugs, Beijing 102629, China

To establish a method for the determination of long chain fatty acid N-palmitoyl-L-glutamic acid residue in liraglutide by UPLC-MS. The results provide ideas for the residues of fatty acid in long-acting fatty acid modified insulin and GLP-1 analogues.ACQUITY UPLC peptide BEH C4 (2.1 mm × 150 mm, 2.7 μm), mobile phase A was formic acid/water (1:1000,/), mobile phase B was formic acid/acetonitrile (1:1000,/). Gradient elution: 0 - 10 min, 35% - 95% B; 10 - 10.5 min, 95% - 35% B; 10.5 - 15 min, 35% B. The flow rate was 0.3 ml/min, the column temperature was 50 ℃, the sample tray temperature was 25 ℃, the detection wavelength was 214 nm, and the injection volume was 2 μl. The UPLC-HRMS was used to establish the identification of N-palmitoyl-L-glutamic residue. Selected ion monitorwas carried out by ESI+scanning and quantification ion m/z 386.2901 (C21H39NO5, [M+H+] 386.2901).This method was highly exclusive. The separation of N-palmitoyl-L-glutamic acid and liraglutide was good. The linearity between peak area and concentration of N-palmitoyl-L-glutamic acid was achieved in the range of 0.0125- 2 μg/ml (= 1.000). The average recoveries of N-palmitoyl-L-glutamic acid was 98.2% (= 9, RSD% = 3.7%).This method is suitable for the determination of N-palmitoyl-L-glutamic acid residue of liraglutide with better accuracy, repeatability, precision and durability, and provides reference and data support for the detection of fatty acid residues in similar products.

liraglutide; liquid mass combination; process-related impurities; N-palmitoyl-L-glutamic acid; high resolution mass spectrometry; selected ion monitor

LIANG Cheng-gang, Email: liangchenggang@nifdc.org.cn; LI Jing, Email: li_jing@nifdc.org.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.003

中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金（2022A3）

梁成罡，Email：liangchenggang@nifdc.org.cn；李晶，Email：li_jing@nifdc.org.cn

2022-06-07